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你真的了解 TA 克隆嗎？
發(fā)布時(shí)間： 2021-08-25 點(diǎn)擊次數(shù)： 3090次首先，TA 克隆是用于 PCR 產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。原理是利用 Taq 酶能夠在 PCR 產(chǎn)物的 3’末端 加上一個(gè)非模板依賴的 A，而 T 載體是一種帶有 3’T 突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把 PCR 產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)中。
那么在你做 TA 克隆時(shí)，需要準(zhǔn)備的前期工作是什么呢？
1 、設(shè)計(jì)引物 P 出你的目的基因
不管你是手動(dòng)設(shè)計(jì)還是軟件設(shè)計(jì)或是直接引用別人已經(jīng)發(fā)表文章用到的引物，只要能 P 出 來(lái)目的片段就行，在 PCR 的結(jié)果中需要注重 P 出來(lái)的濃度，要達(dá)到濃度高的要求一方面是在前期的樣本準(zhǔn)備本身就得到高濃度。
比如要 P 出一種病毒的某部分基因，那么在病毒的 RNA 提取時(shí)，就必須保證該病毒的病變效果明顯，才有可能得到高濃度的 RNA，繼而或者逆轉(zhuǎn)錄得到高濃度的 cDNA。
另一方面是在 PCR 的條件時(shí)對(duì)于退火溫度等的條件把握，如果有一些引物二聚體存在，那么可以嘗試提高退火溫度，延長(zhǎng)一點(diǎn)延伸時(shí)間，但具體如何使得 PCR 跑出來(lái)又亮又單一，還是需要摸摸條件。
2 、切膠回收產(chǎn)物
在紫外儀下切下目的產(chǎn)物，注意一定要快準(zhǔn)狠，盡快切下，并盡可能少的切下多余的膠，回收利用的試劑盒一般嚴(yán)格按照試劑盒操作應(yīng)該沒(méi)有什么問(wèn)題。回收之后測(cè)濃度，準(zhǔn)備下一步。
3 、連接
這一步驟就直接按照選擇的 T 載體說(shuō)明書來(lái)操作了，需要注意的是，在上一步測(cè)完回收濃度后，如果濃度較低，建議在試劑加量上盡量加大 DNA 的用量。
一般來(lái)說(shuō)回收之后就趕緊地進(jìn)行連接，但是由于有時(shí)候可能中間時(shí)間耽誤了，沒(méi)能及時(shí)連接， 那么在這之前可以補(bǔ)加兩個(gè)步驟，一是加 A 尾，二是純化回收的產(chǎn)物。
但是在長(zhǎng)期的嘗試中，我發(fā)現(xiàn)純化與否和手動(dòng)加 A 尾并不怎么影響連接效果。
4 、轉(zhuǎn)化鋪板
這個(gè)步驟用來(lái)篩選重組子，長(zhǎng)出來(lái)的菌多不是好事，菌少也不是壞事，也許就只長(zhǎng)兩個(gè)單克隆菌，但這兩個(gè)都是陽(yáng)性重組子，反正只要挑到正確的就行。
5 、菌液 PCR 鑒定
一般挑菌之后在 EP 管中搖個(gè) 3 到 5 個(gè)小時(shí)就可以進(jìn)行菌液 PCR 了，一般來(lái)說(shuō)這樣的搖菌時(shí)間能最保證接近真實(shí)的陽(yáng)性結(jié)果，菌液 PCR 之前有人建議說(shuō)要煮沸幾分鐘再 P，但其實(shí)直接取搖菌的 1ul 作為模板，進(jìn)行 PCR 就可以了，條件與之前 P 產(chǎn)物的條件一致。
6 、酶切鑒定
酶切位點(diǎn)的選擇必須要確保目的基因中沒(méi)有這個(gè)位點(diǎn)，而載體與目的基因連接附近有位點(diǎn)。在進(jìn)行酶切的時(shí)候是要摸酶切時(shí)間的，是否已經(jīng)切開(kāi)跑一個(gè)電泳看看。
7 、測(cè)序鑒定
如果實(shí)在是覺(jué)得上面兩個(gè)鑒定都拿不準(zhǔn)，那也可以嘗試測(cè)序，如果測(cè)序結(jié)果與目的基因能夠*比對(duì)匹配上，那么也說(shuō)明就是連接上了。
其實(shí) TA 克隆是非常簡(jiǎn)單的克隆，先天的條件 A 和 T 都已經(jīng)具備了，除非你手實(shí)在不順，連個(gè) 2500bp 以下的都是沒(méi)什么問(wèn)題的。
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