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分享總結(jié)Western跑磷酸化蛋白的要點(diǎn)

發(fā)布時(shí)間： 2021-09-17　　點(diǎn)擊次數(shù)： 3740次

抗體
工欲善其事必先利其器，抗體很關(guān)鍵。這里我們要說的并不是最貴的就是好的，如果條件允許，建議同時(shí)購買不同廠家的抗體，一起來試一試，因?yàn)橛袝r(shí)候即使是好的品牌，不同批次穩(wěn)定性也不一樣。抗體從訂購到到貨有一定的時(shí)間，所以到貨后請(qǐng)盡快分裝好，準(zhǔn)備做實(shí)驗(yàn)，如果實(shí)驗(yàn)進(jìn)度跟不上的問題，導(dǎo)致抗體到了后拖了很久才正式實(shí)驗(yàn)，這樣拖了時(shí)間找廠家售后申訴也是很被動(dòng)的。用 CST 的一抗，效果不穩(wěn)定，也可能跟抗體放久了有關(guān)。最后買了另一家代理的抗體算是有了比較穩(wěn)定的結(jié)果。當(dāng)然，還是選擇購買口碑較好的公司的產(chǎn)品為佳，這樣即使出了問題售后也會(huì)跟進(jìn)。如果經(jīng)費(fèi)有限，可以買買小包裝的產(chǎn)品先試試，不少抗體公司還有 5ul 的抗體試用裝免費(fèi)申請(qǐng)。再者，孵育一抗的時(shí)候，建議用新鮮抗體，什么意思呢？很多同學(xué)因?yàn)橄雸D省事兒，很多時(shí)候配好孵育液，每次孵育好之后再次放進(jìn)冰箱等待下次重復(fù)利用，一些比較好跑的蛋白到時(shí)沒啥問題，但是磷酸化的蛋白建議每次都用新鮮的抗體原液，將條帶剪下來后用雜交袋塑封好，按 1：1000 的比例加入抗體原液孵育，再這種情況下，100ul 的抗體也是能用很久的，所以盡量每次都用新的抗體。

蛋白上樣
普遍反映磷酸化的條帶很淡，有時(shí)候達(dá)不到制圖標(biāo)準(zhǔn)，這點(diǎn)可以加大上樣量來解決，另外，磷酸化蛋白一般與非磷酸化的蛋白一起跑一起制圖，它本來就是要比非磷酸化的要淡一些，不要過分擔(dān)心。

電泳
不同 kb 的蛋白電泳時(shí)間有所差別，參數(shù)啥的要用腦子更改，不能一成不變，避免發(fā)生那種蛋白跑不見了的慘劇。

封閉
這個(gè)步驟非常重要，強(qiáng)推 BSA 封閉，不要用脫脂奶粉封閉，BSA 封閉對(duì)磷酸化的抗體效果非常好，而且也不貴。另外，BSA 封閉液倒是可以反復(fù)使用不至于向奶粉一樣臭掉，用來孵育一般非磷酸化的抗體，效果同樣棒棒噠！再者，封閉時(shí)間可以延長，一般封閉 2-3 小時(shí)的情況下，可以封閉延時(shí)到 4 小時(shí)，所以按照從早到晚做實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，用 BSA 配好封閉液開始封閉的時(shí)候，您就可以慢慢的約個(gè)火鍋唱個(gè)歌再回來了，實(shí)驗(yàn)本來就很辛苦，不要再依賴外賣小哥了。

洗膜
嚴(yán)格遵守洗膜時(shí)間，不得減少次數(shù)，每個(gè)步驟洗 3 次，每次可以洗長一點(diǎn)，比如（11-12 分鐘）。

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