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用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標(biāo)記哺乳動物細(xì)胞的方法

發(fā)布時間： 2021-11-08　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2813次

材料與儀器
細(xì)胞
培養(yǎng)基
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 制備活躍生長著的細(xì)胞。從單層培養(yǎng)細(xì)胞（約鋪滿 75% 表面積）中吸去培養(yǎng)基。用預(yù)熱至 37℃ 的無血清培養(yǎng)基沖洗兩次（培養(yǎng)基中應(yīng)該不含蛋氨酸和半胱氨酸）。對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，通過 400 g 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。用頂熱至 37℃ 的無蛋氨酸培養(yǎng)基重懸沉淀，400 g 離心 5 分鐘。盡可能地去掉上清，用無蛋氨酸培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至 107 細(xì)胞/ml 后轉(zhuǎn)移至一塊小培養(yǎng)板。

2. 加入預(yù)熱的無蛋氨酸和半胱氨酸的培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 20 分鐘，以耗盡胞內(nèi)含硫氨基酸庫。

3. 吸去培養(yǎng)基，立刻換上預(yù)熱的、無蛋氨酸和半胱氨酸何含有適量標(biāo)記氨基酸的新鮮培養(yǎng)基，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞于 37℃ 培養(yǎng)一定時間（對于末做過預(yù)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)，以 2~4 小時作為初始值比較合適）

4. 移去放射性培養(yǎng)基。對于單層培養(yǎng)細(xì)胞，吸出即可。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞則可轉(zhuǎn)至試管，400 g 離心 5 分鐘，倒去上清。

5. 準(zhǔn)備一塊凍至 0℃ 的平板（如放在冰盒上的鋁板），將單層細(xì)胞培養(yǎng)板放上去。用冰冷的 PBS 沖洗兩次，沖洗液都到進(jìn)放射性廢料桶。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞用 PBS 重懸，400 g 離心 5 分鐘，倒去上清。

6. 抽干細(xì)胞上殘留的 PBS，裂解細(xì)胞。

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