步驟

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴增緩沖液

5X DD-PCR 反轉錄緩沖液（250 mmol/L Tris-Cl（pH 8.3），375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2）

DTT ( 100 mmol/L)

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

胎盤 RNase 抑制劑（20 單位/ml）

5X 測序膠上樣緩沖液

2. 酶與緩沖液

反轉錄酶（RNA 依賴的 DNA 聚合酶)

用于 DD-PCR 中的反轉錄酶是一種 RNaseH 活性缺陷型的酶（如購自 Life Tech-nologies 公司的產品 Superscript 或者購自 Stratagene 公司的產品 StrataScript）。

熱穩定 DNA 聚合酶

3. 核酸與寡核苷酸

錨定 3'-寡核苷酸引物（300 μg/ml）溶于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 中，內含有 0.1 mmol/L EDTA

隨機 5'-寡核苷酸引物（50 μg/ml）溶于 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.6）中，內含有 0.1 mmol/L EDTA

總 RNA（100 μg/ml）

4. 凝膠

瓊脂糖凝膠

電解質梯度測序膠

5. 放射性物質

帶放射標記的 dATP（10 μCi/μl，放射性比活度為 3000 Ci/mmol）

6. 專用設備

自動微量移液器的屏蔽型槍頭

離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）

正向排液式移液器

PCR 儀

水浴箱水溫預設在 65℃ 和 94℃



二、方法

優化 DNA 濃度：cDNA 第一鏈的制備

1. 用幾支 0.5 ml 離心管，設立實驗反應管系列，建立對照管和實驗管的 RNA 最佳濃度，所謂最佳濃度指后續 DD-PCR 擴增在凝膠電泳和放射自顯影上呈現 100~300 條譜帶。用水對 RNA 樣品進行 5 倍連續稀釋系列，產生 RNA 樣品濃度范圍在 1 μg/ml 與 100 μg/ml 之間系列。

2. 從錨定 3'-寡核苷酸引物庫中選擇一個或更多的引物，設立不同的稀釋 RNA 模板量的復性反應系列：

RNA 模板                  8.0 μl

錨定 3'-寡核苷酸引物  2.0 μl 

反應管在 65℃ 水浴上溫育 10 min，然后放置在 37℃ 水浴上。

復性反應中總 RNA 量應該在 8 ng 至 800 ng 之間變動。

3. 加入如下復性反應試劑：

5X DD-PCR 反轉錄緩沖液         4 μl

100 mmol/L DDT                      2 μl

200 μmol/L 4 種 dNTP 混合液    2 μl

約 25 單位/μl RNase 抑制劑      0.25 μl

200 單位/μl 反轉錄酶                0.25 μl

H2O 補足至                             20 μl

反應管溫育樣品管在 37℃ 反應 1 h。

4. 將反應管內樣品在 94℃ 加熱 10 min，使反轉錄酶失活。

優化 RNA 濃度：雙鏈 cDNA 的擴增與制備

5. 用 8 只 0.5 ml 擴增管設立兩個實驗系列。每只管應該包含如下試劑：

10X 擴增緩沖液                                                2 μl

錨定 3' 寡核苷酸引物                                        2 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 8.0)              1 μl

[α-33P] dATP 或 [α-35S] dATP ( 3000 Ci/mmol） 1 μl

5 單位/μl 熱穩定 DNA 聚合酶                            1 單位

H2O                                                                9 μl

對于每支反應管加入 2 μl 5' 隨機引物，輕彈管壁使反應液混勻。

6. 從含有測試 RNA 與對照管 RNA 的反轉錄的兩個系列的 8 支試管中各取 3 μl 樣品，蓋上試管，輕輕混勻樣品。

7. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層加一滴礦物油（約 50 μl）。放置離心管在 PCR 儀上。

8. 擴增反應有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：

9. 擴增反應程序運行結束后，從 PCR 儀取出反應管，每只反應管各加入 5 μl 5X 測序膠上樣緩沖液。

10. 應用 DNA 序列分析型的電解質梯度聚丙烯酰凝膠電泳分離這種放射標記擴增物電泳在穩壓電源作用下進行，到二甲苯腈藍電泳至凝膠長度的三分之二處結束。抽干凝膠，將凝膠放置在放射自顯影底片的下部壓片。

11. 檢查對照與試驗 RNA 的不同濃度來源的擴增反應產物的 DNA 條帶譜型。一種理想的差異顯示的條帶譜型最好能清晰地分辨 100~250 條電泳譜帶。DNA 模板的最佳量對于不同的樣品、不同的引物也是個不相同的。選擇對照與試驗 RNA 的最適濃度，使得在該濃度下引物配對引導擴增得到最大量的 DNA 產物。

用于差異顯示的擴增 cDNA 的制備

12. 應用所有的引物組合與 RNA 模板最佳量，重新復性，反轉錄和擴增反應。設計在 PCR 儀上用 96 孔板即微量滴定板設立所有的反應循環。

13. 應用聚丙烯酰胺測序膠電泳分離擴增反應產物，如步驟 9 和 10。用每對引物所獲得的擴增反應樣品上樣在測序凝膠上的毗鄰的泳道上，比如應用配對引物 A + B 從一種 RNA 樣品所獲得的擴增樣品與同一對引物 A+B 從另一種 RNA 樣品所獲得的另一個擴增產物在凝膠泳道上相鄰。用這種方法對于樣品編排序號后大大簡化了對于放射自顯影帶譜的比較研究。

14. 從不同的 RNA 樣品中用每一對引物所獲得的擴增產物的帶譜的比較研究。

在鑒定不同的表達條帶時，通常重復試驗確定初始發現的可重復性是極為重要的方法。盡管這種預防措施可能不具有可操作性的，但在理想的情況下，兩種 RNA 的不同批次的樣品應該被同時應用，便于相互印證。

差異顯示的 cDNA 的回收與重擴增

15. 從抽干的聚丙烯酰胺凝膠上回收目的條帶。防止放射自顯影 X 線片在凝膠的上方，對于放射自顯影 X 線片上的目的條帶的位置用軟鉛筆輕劃標記。用干凈的剃須刀刀刃沿鉛筆標記將上層的放射自顯影膠片與下層的凝膠一并切割，切下每一條目的條帶，將目的條帶的凝膠條貼放在 Whatman 3 MM 紙上；將每一薄片的抽干凝膠紙片放入一只 0.5 ml 的離心管（內有 50 μl 滅菌水）。

16. 用小的針穿刺每一只浸泡過夜的 0.5 ml 的離心管的底部；把每一只穿刺管放入一只 1.5 ml 離心管中，離心 20s 后將洗脫液轉移至另一只更大的離心管中，丟棄擴增管中殘余的凝膠條和 Whatman 3 MM 紙條。

17. 用已洗脫液中的 DNA 片段作模板，在擴增反應管中一次加入如下試劑：

10X 擴增反應緩沖液                             2 μl

聚丙烯酰胺凝膠中洗脫的 DNA 樣品       3 μl

5'-隨機寡核苷酸引物                             2 μl

3'-錨定寡核苷酸引物                             2 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 7.0)  1 μl

5 單位/μl Taq 熱穩定 DNA 聚合酶          2 單位

H2O                                                    9.5 μl

18. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl）。放置離心管在 PCR 以上。

19. 擴增反應有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度如下表：

20. 抽取每種重擴增樣品的 5%~10%，用 1% (m/V) 瓊脂糖凝膠電泳來估計出重擴增 DNA 片段的含量。

21. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層（步驟 18），反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

22. 將重擴增 DNA 片段連入一種帶有 dT 尾的載體（如 Promega 公司出品的 pEGM T 載體），取部分連接液轉化大腸桿菌宿主菌。

23. 從培養平皿上挑取 6 個或更多個轉化菌落，抽提其質粒 DNA，應用相應的限制性內切核酸酶進行酶切鑒定，通過比較插入片段的大小確定重組轉化子。

24. 應用盡可能多的途徑和方法對差異表達的候補的 cDNA/mRNA 分子進行確證，這種確證方法包括 Northern 雜交，RNase 保護或定量 PCR。應用 mRNA 原位雜交技術能夠對來自某種疾病或不同發育階段的組織和差異表達的特異轉錄產物進行組織定位。

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