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如何提高蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）的成功率？

發(fā)布時(shí)間： 2022-01-05　　點(diǎn)擊次數(shù)： 3140次

近些年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究是生物領(lǐng)域比較熱門(mén)和研究廣泛的方向。而Western Blot實(shí)驗(yàn)是研究蛋白組學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)操作。但是一個(gè)成功的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要注意很多細(xì)節(jié)。

Western Blot即蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，利用抗原抗體特異性結(jié)合來(lái)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量。蛋白質(zhì)印跡法是由瑞士*弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學(xué)》（Analytical Biochemistry）中第一次被稱(chēng)為Western Blot。蛋白免疫印跡（Western Blot）是將電泳分離后的細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)方面。

下面詳細(xì)介紹每一步的操作：

一、樣品的制備

樣本來(lái)源一般分為細(xì)胞和組織，常用的裂解液為RIPA（強(qiáng)）裂解液，需要加入適量的蛋白酶抑制劑。根據(jù)所收集的細(xì)胞沉淀多少或組織塊大小，加入適量的裂解液。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，冰上裂解10min或30min，定時(shí)進(jìn)行渦旋震蕩。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入Loading Buffer于99℃的金屬浴上煮樣10min。

*加入的Loading Buffer目的

主要成分	主要功能
SDS	使蛋白質(zhì)變性并帶上負(fù)電荷
甘油	增加樣品密度，使樣品沉降
溴酚藍(lán)	離子型染料，可觀察蛋白的遷移
DTT	減少二硫鍵的形成

二、凝膠電泳

* SDS凝膠配置原則：

先配置分離膠，再配置濃縮膠；

分子量越高，分離膠濃度越低；

根據(jù)上樣量選擇對(duì)應(yīng)的玻璃板和梳子。

配膠成分表：

	分離膠15%	分離膠12%	分離膠10%	分離膠8%	濃縮膠5%
總體積	10ml	10ml	10ml	10ml	5ml
30%丙烯酰胺（29:1）	5ml	4ml	3.3ml	2.7ml	0.83ml
4XSDS-PAGE濃縮膠	0	0	0	0	1.25ml
4XSDS-PAGE分離膠	2.5ml	2.5ml	2.5ml	2.5ml	0
10%過(guò)硫酸銨	40ul	40ul	40ul	40ul	30ul
TEMED	4ul	4ul	4ul	4ul	3ul
ddH₂O	2.4ml	3.4ml	4.1ml	4.7ml	2.84ml
最佳分離范圍	10-40KD	12-60KD	20-80KD	30-90KD	——

配膠注意事項(xiàng)：

（1）清洗玻璃板：可以先用海綿擦清洗玻璃板，在用去離子水潤(rùn)洗一次，可以放置于烘箱或通風(fēng)廚中晾干。

（2）按照配膠表進(jìn)行配置，充分混勻后在玻璃板中灌膠。

（3）加水或者醇類(lèi)液封，速度要慢，防止將分離膠沖不勻或變形。

* 電泳

采用SDS-PAGE電泳，每孔上樣量可為20-50ng。在適當(dāng)空內(nèi)加入marker。先用80V電壓使樣品進(jìn)行充分濃縮，到達(dá)分離膠后調(diào)為120V，當(dāng)溴酚藍(lán)要跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

* 轉(zhuǎn)膜

一般分為PVDF膜和NC膜，PVDF膜價(jià)格較貴，結(jié)合能力較強(qiáng)；NC膜價(jià)格便宜，結(jié)合能力較PVDF膜差，不能重復(fù)使用。

PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固。大于20 kDa的蛋白選用0.45 um的膜，小于20 kDa的蛋白選用0.2 um的膜。PVDF膜在使用時(shí)需預(yù)處理，用甲醇激活15s，目的是活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合（注意：不要有氣泡！不要將膠放干！原理：電場(chǎng)力作用條件下，PAGE膠中的帶負(fù)電荷的蛋白會(huì)發(fā)生定向遷移）。轉(zhuǎn)膜過(guò)程會(huì)產(chǎn)熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，因此要使用冰袋散熱。目前市面上的快速轉(zhuǎn)膜液可以在常溫下400mA轉(zhuǎn)30min完成，方便快捷。

注意事項(xiàng)：

如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過(guò)大而相互接觸，這樣同樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過(guò)膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的，最后結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的 1.5-3 倍都是正常的。一般 Buffer 和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。

轉(zhuǎn)膜方法：濕轉(zhuǎn)

轉(zhuǎn)膜后可以用麗春紅對(duì)膜進(jìn)行染色，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)膜效率。

* 封閉

一般用5%的脫脂奶粉或者5%的BSA進(jìn)行封閉。對(duì)于磷酸化或者生物素標(biāo)記的抗體只能用5%的BSA。封閉是假為室溫1-2h。目的是去除非特異性結(jié)合。

* 一抗孵育

封閉后用TBST潤(rùn)洗一次，然后根據(jù)蛋白的分子量大小進(jìn)行裁膜，將對(duì)應(yīng)的膜放入用一抗稀釋液配好的抗體中（具體稀釋比例要根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。在4℃條件下置于搖床上孵育過(guò)夜。

* 洗膜

一抗孵育結(jié)束后，回收一抗，用TBST洗膜，每次7min，洗3次。

* 二抗孵育

洗膜結(jié)束后，加入配好的二抗（對(duì)應(yīng)好一抗的種屬來(lái)源），室溫下置于搖床上1h，然后回收二抗，再次洗膜。

* 顯影

將PVDF膜洗干凈后，滴加ECL發(fā)光液，孵育1min左右，可進(jìn)行顯影。

Western Blot可能遇到的問(wèn)題：

無(wú)顯色信號(hào)問(wèn)題的原因分析：

1．裂解產(chǎn)物中抗原含量不足；

a. 抗原無(wú)表達(dá)或表達(dá)量過(guò)少

b. 蛋白降解或上樣量不足

c. 裂解產(chǎn)物制備失誤

2．制膠濃度比例不合適；

3．轉(zhuǎn)膜不*；

4．一抗稀釋濃度過(guò)大；

5．二抗與一抗不匹配；

6．顯色系統(tǒng)靈敏度不足

非特意性雜帶出現(xiàn)的原因分析：

1．封閉或清洗不*；

2．一抗?jié)舛冗^(guò)高；

3．蛋白降解；

4．抗體與非特異性蛋白交叉反應(yīng)；

5．蛋白間聚集作用，形成二聚體；

6．轉(zhuǎn)移膜使用不當(dāng)；

7．操作過(guò)程中轉(zhuǎn)移膜干燥

有一些污點(diǎn)的原因分析：

1．轉(zhuǎn)膜有氣泡；

2．孵育不均勻；

3．脫脂奶粉沒(méi)有充分溶解

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