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氨基酸代謝標記實驗
發布時間： 2022-03-10 點擊次數： 1903次原理
在含有放射性標記氨基酸的培養基中，短期培養細胞（<30min）對蛋白質進行脈沖標記。
材料與儀器
37℃ 細胞懸液 [35S]標記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標記蛋白質水解產物
PBS(冷凍) 37℃ 脈沖標記培養基
配有液體同位素垃圾閥門的真空吸氣器步驟
1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸，并用預熱的（37℃）脈沖標記培養基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。
2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~2 × 107 細胞。用 10 ml 預熱的脈沖標記培養基洗細胞。室溫下 300 g 離心 5 min, 吸棄上清。輕柔敲打試管底部使細胞重懸并再洗一次。
3. 用預熱脈沖標記的培養基重懸細胞，使其濃度為 5 × 106/ml。在 37℃ 水浴中溫育 15 min 以去掉細胞內的甲硫氨酸。定時顛倒試管來使細胞重懸。
4. 室溫下 300 g 離心 5 min，吸棄上清。用 2 ml [35S] 標記甲硫氨酸的工作溶液（見步驟 1）重懸細胞，轉移至干凈 15 ml 離心管中。蓋緊蓋子。在 37℃ 水浴中溫育 10~30 min, 不時輕柔顛倒試管或振蕩使細胞重懸。
5. 4℃、300 g 離心 5 min，吸棄上清。用 10 ml 冰預冷的 PBS 輕柔重懸并再次離心。
6. 可選：通過三氯乙（yi）酸（TCA）沉淀來測定標記物的摻入量（見輔助方案）。
7. 如果細胞沉淀不馬上使用的話，可以置于冰上幾小時或 80℃ 保存幾天。分析前冰上融化細胞沉淀。
注意事項
1. 在標記過程中，揮發性的含有[35S]標記的化合物可能會釋放，含有[35S]標記甲硫氨 酸的培養基應保存在密閉緊蓋的試管中，用前置于37°C水浴。在37°C不能超過60 min。
2. 在大多數情況下，冷凍細胞不會影響蛋白質的生物化學特性，但是在用去污劑溶解后再凍融細胞 抽提物可引起多亞單位復合物的解離或標記蛋白質降解。
常見問題
1. 實驗材料中的細胞懸液可以選擇如 Jurkat、RBL、K562、BW5147、T 和 B 細胞雜交瘤等，要求是生長于潮濕、37℃、5% 032溫箱中或從組織中制備（如淋巴細胞）。
2. 脈沖標記不會使培養基中的標記物*喪失，因此標記混合物可以重復使用。收集標記的培養 基，小心地用0.45 μm的濾器濾過。細胞標記前后通過閃爍記數標記混合物來估計未摻人放射活 性的百分比。-20°C冷凍條件下標記的混合物可以保存2個月。
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