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備擇方案 2 示蹤標(biāo)記細(xì)胞

發(fā)布時間： 2022-03-10　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1548次

原理
材料與儀器
細(xì)胞懸液／貼壁細(xì)胞 [35S]標(biāo)記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標(biāo)記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
PBS(冷凍) 37℃ 示蹤培養(yǎng)基
配有液體同位素垃圾閥門的真空吸氣器
步驟
1. 每個時間點(diǎn)和每個樣品準(zhǔn)備 0.5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞，每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標(biāo)記 10~30 min （見基本方案步驟 1~4，或見備擇方案 1 步驟 1~5）。

2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液，用 10 ml 37℃ 的示蹤培養(yǎng)基洗一次，并加入 10 ml 37℃ 的示蹤培養(yǎng)基。

3. 37℃ 培養(yǎng)到預(yù)期時間。擰緊試管蓋子在旋轉(zhuǎn)情況下培養(yǎng)細(xì)胞懸液。在 032 培養(yǎng)箱里孵育貼壁細(xì)胞。

4. 刮取貼壁細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管。收集刮取的細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液于 4℃ 300 g 離心 5 min。

5. 可選：通過 TCA 沉淀法測定標(biāo)記摻入的量（見輔助方案）。
注意事項
1. 將2倍體積含有過量未標(biāo)記甲硫氨酸（15mg/L）的示蹤培養(yǎng)基直接加入到標(biāo)記混合物中，能夠快速終止標(biāo)記反應(yīng)。
2. 示蹤≤2 h，細(xì)胞懸液的最終濃度應(yīng)該是 2 × 106 細(xì)胞/ml，或示蹤>2 h，用 0.5 × 106 細(xì)胞/ml。對貼壁細(xì)胞而言，加 10 ml/100 mm 平皿。
常見問題
1. 上清可以棄掉，也可以收集起來用于分析分泌或脫落到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。
2. 如果細(xì)胞沉淀不馬上使用的話，見基本方案步驟7。
同實(shí)驗其他方法
氨基酸代謝標(biāo)記實(shí)驗
1. 室溫融化 [35S] 標(biāo)記甲硫氨酸，并用預(yù)熱的（37℃）脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~
備擇方案 1 對貼壁細(xì)胞
1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細(xì)胞，取決于細(xì)胞類型）。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1
備擇方案 3 長期細(xì)胞標(biāo)記
1. 在預(yù)熱的 37℃ 長期標(biāo)記培養(yǎng)基中制備 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（見基本方案步驟 1）。2.1 對于懸浮細(xì)胞：用預(yù)熱的長期標(biāo)記培養(yǎng)基準(zhǔn)備并洗細(xì)胞一次
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