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輔助方案 TCA 沉淀測定標記摻入量

發(fā)布時間： 2022-03-10　　點擊次數(shù)： 1748次

原理
材料與儀器
被標記的細胞懸液（見基本方案或備擇方案 1～4）
0.1％（m V）BSA／0.02%（m V）NaN3 10%TCA 溶液冷凍乙醇
連接真空管道的濾過裝置 2.5 cm 玻璃微纖維濾膜（Whatman GF／C）
步驟
1. 加 10～20 μl 被標記的細胞懸液到 0.1 ml 0.1％（m/V）BSA/0.02％（m/V）NaN3 中，置于冰上。

2. 加 1 ml 冷凍的 10％（m/V）TCA 溶液。劇烈振蕩混勻，在冰上孵育 30 min。

3. 在真空濾過裝置內(nèi)，濾過細胞懸液到 2.5 cm 玻璃微纖維濾膜上。

4. 用 5ml 冷凍 10％TCA 溶液洗膜 2 次，再用乙醇洗 2 次。空氣干燥 30 min。

5. 在玻璃微纖維濾膜上點同樣體積（見步驟 1，10～20 μl）的放射性標記的細胞懸液，在空氣中干燥。

6. 轉(zhuǎn)移濾膜到 20 ml 閃爍管里，加 5 ml 閃爍記數(shù)溶液，用閃爍記數(shù)儀測定放射活性。

7. 計算 TCA 沉淀標記（見步驟 4）與總放射活性的比值（見步驟 5）。
注意事項
１. TCA 有強烈腐蝕性。在制備和操作 TCA 溶液時注意保護眼睛并避免皮膚接觸。
2. 洗液應(yīng)按照混合化學/放射性廢棄物處理。根據(jù)安全規(guī)程進行處理。
常見問題
同實驗其他方法
氨基酸代謝標記實驗
1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸，并用預熱的（37℃）脈沖標記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~
備擇方案 1 對貼壁細胞
1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細胞，取決于細胞類型）。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1
備擇方案 2 示蹤標記細胞
1. 每個時間點和每個樣品準備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞，每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標記
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