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單鏈 cDNA 的合成
發布時間： 2023-04-21 點擊次數： 1505次材料與儀器
步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
去除 RNA 酶的雙蒸水
10XRT-PCR 緩沖液（去除 RNA 酶的雙蒸水，100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶緩沖液
MMLV 逆轉錄酶（100~200U/ul)
SUPERaseINRNA 酶抑制劑（20U/ul;Ambion)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四種 dNTP)
隨機引物（5umol/L)
總 RNA(達到 2.5ug)
4. 實驗器材
薄壁的 PCR 管
二、方法
1. 在冰上加 2ul50umol/L 的隨機引物到薄壁的 PCR 管中（一個反應一管)。
2. 加入 2.5ug 的總 RNA。
3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。
4. 添加去除 RNA 酶的雙蒸水（RNaSe-freeH20)，使體積達到 16ul。
5.70°C 加熱 10min, 變性二級結構，然后立即放在冰上。
6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 緩沖液。
7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。
8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆轉錄酶。
9.42°C 溫浴 1h。
10.95°C 加熱10min, 滅活逆轉錄酶。11. 繼續擴增步驟或停止反應，-2°C 儲存。
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