-
質粒構建的心得分享
發布時間： 2024-02-20 點擊次數： 1317次質粒是我們日常實驗中比較常用的載體，其可以自主生長，也能通過比較容易的方法進行大量擴增，但往往單一的質粒不能滿足實驗需求，需通過一系列方法進行質粒重組，我目前比較常用的方法也就是比較陳舊的酶切重組質粒的方式，簡易實驗過程如下圖：
在這個過程中，有幾個小Tips：
1.原載體的酶切位點由文獻、載體說明書或者導師建議得來，選擇正確的酶切位點是重組質粒開始的第一步，常見的酶切體系如下：
上述體系適用于大多數酶切，不是特別難切開的載體1μl內切酶足夠，酶切前計算好量，先加ddH2O，最后加內切酶。
2.酶切完成后，需要跑瓊脂糖膠鑒定酶切效果，配膠時注意選擇合適的膠濃度，原則是分子量越大，膠濃度越小。跑膠完成后紫外燈下一般會有兩段即為成功：載體和切下來的片段，根據結果進行膠回收，注意切下來的片段不回收，膠回收完成后測濃度備用。
3.插入片段根據自己的實驗選擇，通常插入片段可以通過PCR而來，或者是一段由三方公司合成的序列，在連接開始前也需要用同樣的兩個內切酶切出缺口。常見連接體系如下：
16℃連接4h以上或過夜。 其中，加入載體和插入片段的量由說明書得來，加樣前計算好量，先加ddH2O，最后加連接酶，由于連接體系較小，一般使用pcr管進行。
4、為確保連接的順利進行，務必保證連接酶和連接酶緩沖液配套使用，即使用同一廠家的，不能混用。
5、上述過程中涉及到的不管是內切酶還是連接酶，都是比較昂貴的，使用時要用冰盒，用完及時放回-20℃冰箱。 6、進行轉化時，根據載體說明書選擇合適的感受肽細胞，同時仔細閱讀感受肽細胞說明書，看清涂板體積、涂板后的培養時間、培養溫度等。 7、挑取單克隆時，推薦至少選擇兩個及以上。 8、搖菌時，注意擰松菌管的蓋子，傾斜放入恒溫（一般為37℃）搖床，搖菌時間12-16h為宜。 9、搖菌完成后進行質粒提取，測濃度后送測序，注意這里會有部分說明書推薦選擇新的內切酶酶切后跑瓊脂糖膠進行鑒定，這也是一種鑒定方式，可以根據酶切片段的大小來判斷重組是否正確，但是，最終確定還是推薦進行測序，因為我們無法保證在整個過程中堿基不會發生突變，可以根據上述方式選擇酶切片段大小正確的質粒進行測序。 測序的準確性對于后續慢病毒感染是非常重要的，因此測序公司的選擇十分重要，尤其出現一些比較難測的結構如shRNA的發卡結構等，測序技術不成熟的話會一直報重疊峰或者測不通的情況。
安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。
可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。
銷售熱線
