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瓊脂糖凝膠電泳的常見問題&分析
發布時間： 2024-02-29 點擊次數： 1869次
（一）同樣大小的DNA一起跑電泳，怎么條帶不一樣大？
DNA條帶不一樣大，本質上是DNA在凝膠中的遷移率不一樣，有的跑得快，有的慢，通常情況同樣大小的DNA，遷移率是一樣的，條帶位置也會一樣。
但遷移率也受很多因素影響，例如DNA的構象。例如環狀超螺旋結構的DNA，和同等大小的線性DNA（例如單位點酶切后的質粒），前者的遷移率要高，表現出來就是看上去超螺旋結構的DNA分子量好像小一點。
（二）為什么有時候加大電泳的電壓，DNA會跑得快，但有時效果卻不明顯？
在較低電壓時，提高電壓，DNA的遷移率也會提高；但如果DNA分子量太大時，增加電壓后對DNA遷移率的提高其實不成比例，說白一點，就是有效果，但不明顯。
例如，當DNA分子量大于2Kb后，施加在電泳槽兩端的電壓不應該高于5V/cm，如果電泳槽長40cm，那么電壓不應該高于200V。
（三）瓊脂糖質量對電泳效果有多大影響？
有時候，換了一個批次的瓊脂糖，或者更換了新的供應商的瓊脂糖后，同樣的樣品進行電泳，效果也會有差異。
最常見的一個原因在于，瓊脂糖本身的質量也是影響電泳結果的一個因素。
瓊脂糖由大量的多糖組成，這些多糖會與硫酸鹽吸附，成為一種叫硫酸化多糖的東西。在電泳時，它會產生正電荷，并向陰極移動，也就是和DNA移動的方向相反。
最終，DNA移動的阻力就增加了。這種現象叫做瓊脂糖的電內滲（EEO）。因此，采購低水平電內滲的瓊脂糖能有效提高分離效果。
（四）電泳緩沖液對電泳效果有多大影響？
電泳時，電泳緩沖液是一種經常需要更換的試劑。
最佳的狀態，應該是，使用同一批次的電泳緩沖液母液進行1X電泳緩沖液的配置和對應檔次電泳的凝膠配置。因為只有這樣操作，才能保證整個離子緩沖環境是一致的。
有時我們會為了圖方便，長期使用一個批次的1X電泳緩沖液進行實驗，甚至到了母液都用完了，還在用之前那個批次的緩沖液進行實驗。這樣就會影響實驗效果了。
另外，常見的電泳緩沖液的使用錯誤，還包括，直接倒入自來水替代電泳緩沖液，或者直接使用10X或50X的母液當緩沖液進行電泳。‘
前者因為緩沖體系內缺乏足夠的離子，造成電導率很低，DNA遷移速度很慢，甚至是靜止了；而后者則因為電導率太高，造成整個緩沖液產熱太厲害，甚至連凝膠都融化了。
（五）低熔點瓊脂糖和普通瓊脂糖有什么區別？有什么用途？
制作瓊脂糖的原料通常是兩種海藻：Gelidium和Gracilaria。普通的瓊脂糖通常可以分離1～25Kb范圍的DNA片段，熔化溫度一般在85～90攝氏度，凝固溫度一般在40～42攝氏度。
對普通瓊脂糖進行固化劑1號修飾后，可以降低瓊脂糖的熔化溫度。有的熔化溫度甚至低至40～45攝氏度！
這么低的熔化溫度有什么意義和應用呢？答案是低熔點瓊脂糖主要應用于DNA的快速回收，想象一下，在比較低的溫度時，例如50～60攝氏度，低熔點的凝膠已經熔化了，但這個溫度下DNA還是很穩定，不會解鏈的。
因此，只需要進行簡單的處理和升溫就能實現DNA的回收，而且這種回收得到的DNA還能直接進行一些下游實驗，例如細菌轉化。
（六）電泳緩沖液就是TAE buffer嘛？還有其他嘛？有什么區別？
其實，瓊脂糖電泳緩沖液有幾種，分別是TAE、TBE和TPE，不過常用的一般是TAE。下面就來看看這三種緩沖液有什么區別。
相同點：大家都是為電泳提供一個離子緩沖環境。
不同點：組份不同，對應的緩沖能力不同，應用場景也略有不同。我們具體來看看。
TAE：Tris-乙酸鹽+EDTA緩沖液組成；緩沖能力最弱，如果長時間的電泳，則不適合。其中一個標志是長時間電泳后，凝膠的陽極一側會發生酸化，凝膠中的溴酚藍會從藍色變為黃色。因此，TAE需要定期更換，才能保證電泳效果。
TBE: Tris-硼酸鹽+EDTA緩沖液組成；TPE：Tris-磷酸鹽+EDTA緩沖液組成；緩沖能力比TAE要高，DNA在后兩種緩沖液中的遷移速度較慢，適用于分離低分子量DNA的電泳實驗。
（七）上樣緩沖液是什么？有什么用？
在正式電泳開始之前，常使用上樣緩沖液(loading buffer)來與樣品DNA混合，這種緩沖液在電泳時有什么用呢？
Loading buffer在瓊脂糖凝膠電泳中的作用主要有三個：
01 它可以增加樣品的密度，確保DNA樣品可以均勻沉入上樣孔內；
02 Loading buffer含有顏色指示劑，除了幫助上樣時觀察樣品是否準確加入孔內
03 這種顏色指示劑主要由溴酚藍和二甲苯藍FF組成，它們兩者在電泳中會按照固定的遷移速度移動，所以，我們還可以在電泳時通過Loading buffer幫助我們觀察條帶的遷移進度
（八）電泳條帶看起來像個微笑的表情是什么原因？
最常見的原因是因為上樣量太大了，常見的凝膠孔位的寬度是5mm，如果往里面加載的樣品超過0.5ug的話，就表明過量了。
最后，電泳時就會出現條帶兩側卷起彎曲（像微笑表情）、模糊不清、條帶拖尾的現象。DNA片段越大，這種現象會越明顯。
需要補充的一點是，并不是所有出現條帶拖尾的現象，都代表樣品量過載，也有可能是含有其他雜質或樣品降解造成的。
（九）點樣孔內出現很亮的條帶，且不動，是什么原因？
DNA分子在電壓的推動下，會向前移動，但如果其分子量非常大，體積也就會變得很大，以至于無法穿過瓊脂糖向前移動。
如果在基因組DNA提取后，樣本中含有蛋白質，那么就很可能出現這種現象。其原因在于基因組中有大量的組蛋白和DNA纏繞在一起，如果提取過程中去除不干凈，這些蛋白就會和DNA一起進入后續電泳中。
而蛋白在瓊脂糖電泳中，無疑是體積超標了，因此整個孔內的DNA也無法移動出去。
以下，我們還整理了一些過往制作的關于瓊脂糖凝膠電泳的視頻，有的是實驗原理，有的是實驗操作，希望對你有幫助。
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