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如何提高DNA濃度/純度測(cè)定的準(zhǔn)確性？

發(fā)布時(shí)間： 2024-04-23　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1329次

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常需要對(duì)樣品進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，它相當(dāng)于一種質(zhì)控，以此來(lái)確保下游實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可靠。

常用的DNA濃度/純度測(cè)定設(shè)備是紫外分光光度計(jì)，它的原理是利用物質(zhì)分子對(duì)紫外可見(jiàn)光譜區(qū)的輻射吸收來(lái)進(jìn)行分析物質(zhì)成分。

這樣來(lái)描述可能有點(diǎn)生硬，我們舉個(gè)栗子：

假設(shè)現(xiàn)在有一樣物質(zhì)A，它溶解在溶液內(nèi)，當(dāng)光照射溶液時(shí)，溶液內(nèi)的A會(huì)吸收一部分的光。不同顏色的光有不同的波長(zhǎng)，A對(duì)不同顏色的光（不同波長(zhǎng)）的吸收程度是不一樣的。

雙鏈的DNA，它能對(duì)波長(zhǎng)為260nm的光進(jìn)行強(qiáng)烈的吸收，吸收的程度可以用一個(gè)叫吸光度的數(shù)值來(lái)測(cè)量，濃度越高的DNA，理論上吸光度也越高。

最后，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度數(shù)值對(duì)比后，就可以知道未知濃度的DNA有多少量了。

DNA濃度測(cè)定通常會(huì)使用紫外分光光度計(jì)，常見(jiàn)的有NanoDrop這類設(shè)備。除了DNA，它還能測(cè)定RNA和蛋白的吸光度。
要提高濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性，需要注意以下幾點(diǎn)：
檢測(cè)之前，務(wù)必充分混勻DNA溶液，因?yàn)檫@類機(jī)器的上樣檢測(cè)體積只需要1-2uL，如果樣品沒(méi)有混勻，那么每次檢測(cè)樣品濃度也會(huì)不一樣。
因?yàn)樯蠘芋w積很小，所以樣品很容易揮發(fā)，如果把樣品加在檢測(cè)基座后不馬上檢測(cè)的話，會(huì)導(dǎo)致測(cè)出來(lái)的樣品濃度偏高。
實(shí)驗(yàn)環(huán)境和耗材的穩(wěn)定性要高。檢測(cè)設(shè)備應(yīng)該在放置在溫度可控、通風(fēng)的環(huán)境下；裝樣品的管子如果不是要進(jìn)行吸取樣品操作的話，需要時(shí)刻緊閉。
每次檢測(cè)完畢，都需要對(duì)檢測(cè)基座或者比色皿進(jìn)行清洗和擦拭，確保不會(huì)有樣品殘留后，再進(jìn)行下一次上樣檢測(cè)。
空白調(diào)零，應(yīng)該使用溶解待檢測(cè)樣品的溶液來(lái)調(diào)零。例如如果用水溶解DNA，那就用水調(diào)零，用其他緩沖液溶解，則用對(duì)應(yīng)的緩沖液調(diào)零。
在測(cè)定后，我們通常會(huì)看到，設(shè)備會(huì)提供幾個(gè)不同的結(jié)果給我們，有的是數(shù)值，例如OD230、OD260，有的是比值，例如OD260:280，那這些結(jié)果代表什么呢？
OD是optical density(光密度)的縮寫(xiě),表示被檢測(cè)物吸收的光密度。
OD=lg(1/trans)，其中trans為被測(cè)物質(zhì)的透光值。
不同的OD以及OD比值，代表不同的意義：

【OD230】
提取核酸時(shí)會(huì)用到各種化合物，它們以鹽離子的形式存在，例如胍鹽、苯氧基離子、硫氰酸酯。
這些鹽離子對(duì)230nm波長(zhǎng)的紫外光有強(qiáng)烈的吸收值。如果測(cè)定核酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)OD230數(shù)值很高，代表溶液中的鹽離子濃度很高。
【OD260】
雙鏈DNA在這個(gè)波長(zhǎng)下會(huì)對(duì)光有強(qiáng)烈的吸收。
【OD280】
芳香族氨基酸在這個(gè)波長(zhǎng)下，有強(qiáng)烈的光吸收。如果該數(shù)值很高，代表DNA溶液中可能存在蛋白質(zhì)的污染.
【OD320】
通常是由光散射造成的。如果該數(shù)值很高，意味著溶液內(nèi)有顆粒物污染、待檢器皿例如比色皿有污漬。
【OD260:OD280】
通常用于判斷DNA或RNA溶液的純度。常用的指標(biāo)是：在OD230數(shù)值較低，OD320數(shù)值較低的前提下。較高純度的DNA，比值應(yīng)該為1.7～1.9之間，較高純度的RNA，比值應(yīng)該為1.9～2.0之間。
當(dāng)然，以上測(cè)定的結(jié)果并非是絕對(duì)計(jì)數(shù)的數(shù)值，它是一個(gè)參考數(shù)值，因?yàn)槲覀冊(cè)跍y(cè)定時(shí)是不涉及用到標(biāo)準(zhǔn)品這樣?xùn)|西，所以，也就是我們測(cè)出來(lái)的數(shù)可以作為一定程度的參考。
而且，當(dāng)一些外界因素影響時(shí)，測(cè)定也會(huì)出現(xiàn)偏差，例如樣本含量非常非常低時(shí)，測(cè)定的數(shù)值誤差就會(huì)很高并不具參考意義，設(shè)備耗材出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，測(cè)定的數(shù)值也會(huì)不準(zhǔn)。
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