-
原位雜交實驗流程
發布時間： 2024-04-23 點擊次數： 1638次原位雜交組織（或細胞）化學簡稱原位雜交，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。
一、合成RNA探針
1、設計探針引物
RNA探針長度500bp最為合適。一輪引物不添加啟動子序列，二輪引物在正向引物的5端加上T7啟動子序列，在反向引物的5端加上SP6啟動子序列。
2、探針合成
用未添加啟動子序列的引物克隆出探針序列的DNA模板，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。膠回收，將其連接到T載體上，轉化涂板，進行質粒提取送測。用添加了T7和SP6啟動子序列的引物再次給探針序列兩端添加上啟動子序列。取一輪以質粒為模板擴增PCR產物進行瓊脂糖進行PCR擴增，凝膠電泳驗證，若條帶單一明亮，膠回收PCR產物用于后續體外轉錄。
3、體外轉錄
利用PCR擴增出的帶有啟動子序列探針的DNA模板，分別用相應的RNA聚合酶進行體外轉錄，得到單鏈RNA探針。探針包括正義探針和反義探針，用正義探針(T7RNA 聚合酶轉錄得到)進行的原位雜交實驗作為陰性對照組，用反義探針(SP6RNA聚合酶轉錄得到)進行的原位雜交實驗為實驗組。體外轉錄體系如下:
組分名稱
體系
探針模板
600ng-1μg
Transcription Buffer (10×)
2μl
RNA Polymerase T7
2μl
NTP labeling mixture (10×)
2μl
RNase Inhibitor (40U/μl)
1μl
RNase-free H2O
補至20μl
混勻后37，孵育2小時。
4.質量檢測、中止消化
轉錄結束后，取1ul轉錄產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，電泳條帶明亮不彌散則進行下一步。驗證后，每管加入2DNase，37消化15min，去除DNA模板。加入2uL0.2MEDTA(pH8.0)終止消化反應。
5.沉降洗滌保存
每管用DEPC水補至100uL，加入2倍體積的的無水乙醇和1/10體積的的3M乙酸鈉，置于-80℃沉降過夜/-20℃沉降30分鐘。將沉降后的體系放入離心機中，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄除上清。加入100uL70%無水乙醇浸洗，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄除上清，在超凈臺風干。將沉淀的RNA探針加入DEPC水溶解，使其濃度為10ng/uL，分裝后放入-80℃保存備用。
注意事項：
（1）DEPC 即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質，是 RNA 酶的強抑制劑。原位雜交在各步處理中，所有液體試劑都應經 DEPC 處理。
（2）含有 Tris緩沖液的溶液中，不能加入 DEPC。
（3）原位雜交引物用同一個遺傳背景的個體克隆全長測序成功，在測序成功的全長序列上設計引物，保證特異性。
二、雜交
1、準備工作
①圓形細胞爬片在濃鹽酸中浸泡過夜，經超純水沖洗后，浸泡在無水乙醇中；②將圓形細胞爬片、玻璃培養皿、金屬鑷子180℃高溫烘4h去除RNase；③取出后靜置1h冷卻，培養皿中加入0.1mg/ml多聚賴氨酸處理。④正、反面各避光浸泡15min；⑤ 用鑷子依次夾取玻片，迅速蘸取DEPC水，正面朝上放在錫箔紙折起的褶皺上，37℃放置3h備用。
2、組織包埋與切片
原位雜交實驗組織石蠟包埋，將包埋好的蠟塊從-20℃取出，刀片、臺面、切片機等用RNase抑制劑噴霧噴灑擦凈，修整好的蠟塊固定于切片機上，切片厚度設置為5μm，將蠟帶在43℃ DEPC水中水浴展開，用多聚賴氨酸處理過的圓形玻片撈取蠟帶，置于錫箔紙褶皺上37℃烘干過夜。
3、脫蠟與復水
鑷子夾取圓形玻片依次于下述玻璃培養皿中：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各6min脫蠟→二甲苯：乙醇（1:1） 6min→無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各6min→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→ 30%乙醇各 4min梯度復水。
4、預雜交
①鑷子夾取圓形玻片至24孔板中，每孔加入500μl DEPC水洗滌4min；②加500μl PBST（1×PBS+0.1%Tween-20)洗滌10min，洗2次；③加300μl 2μg/ml蛋白酶K，37℃消化12min；④加500μl 0.1M TEA孵育10min；⑤加500μl PBST 10min，洗滌兩次；⑥加500μl 4%的多聚甲醛，避光固定20min；⑦加500μl PBST，10min，洗滌兩次；⑧加300μl HB雜交液，60℃預雜交4h。
HB雜交液的配制：
組分名稱
體系
去離子甲酰
10ml
20×SSC
5ml
BR
4ml
酵母tRNA(5μg/ml)
400μl
DEPC H2O
400μl
0.1%Tween-20
200μl
HB現用現配，本次實驗一次配制3份。
5、探針變性與雜交
將200ng探針加入到30μl HB雜交液中，95℃變性5 min，迅速置于冰上冷卻，然后加入到270μl已60℃預熱的裝有HB雜交液中1.5ml 無酶管中，充分混勻后加入到樣品孔中，60℃雜交17h。
6、洗脫探針
洗脫探針所用試劑均需37℃/60℃預熱，并在相應環境中洗脫。
洗脫探針條件
洗脫液
溫度
洗滌時間
洗滌次數
2×SSC
60℃
20min
2
2×SSC
37℃
10min
2
2×SSC
60℃
20min
1
1×SSC
60℃
20min
1
0.2×SSC+ 0.1%tween20
60℃
20min
1
7、封閉、抗體孵育
①向樣品孔加入500μl MaNaT(0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5) 避光洗滌10min，洗滌兩次。②加入300μl Blocking bufferr（1% Blocking reagent, 0.1 M MaNaT, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20）避光封閉1.5h。③按照1：3000比例將Anti-Digoxigenin-AP (anti-DIG-AP; Roche Applied Science)抗體加入到Blocking buffer中，充分混勻后吸取 300μl 加入樣品孔，避光孵育 1h。
8、洗滌抗體
向樣品孔加入500μl MaNaT洗滌抗體,避光洗滌5min重復2遍，再加入500μl MaNaT洗滌抗體，避光洗滌15min重復4遍。
9、顯色及終止反應
吸出 MaNaT，加入 500μl AP Buffer (5.844 μg/ml NaCl, 12.114 μg/ml Tris, 10.1 μg/ml MaCl·6H2O, pH 9.5)洗滌兩次，每次5min；按1:50的比例將 NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)加入 AP Buffer 中，充分混勻后吸取 400μl 加入樣品孔，避光顯色10min，鏡檢觀察到藍紫色信號時，吸出顯色液。
10、復染
吸出 PBST，加入 500μl 4%多聚甲醛固定 40min；吸出固定液，加入 500μl PBST 洗滌兩次，每次 10 min；吸出 PBST，加入 300μl 1%中性紅染液復染。
11、封片
復染后，用鑷子夾取玻片，依次在梯度乙醇(70%, 95%, 100%, 100%)中脫水；在 100%無水乙醇：二甲苯(1:1)中處理浸泡2min；在二甲苯中浸泡5 min；最終以中性樹膠封片。
12、顯微觀察
使用 1 至 4 倍放大倍數觀察組織雜交整體信號表達情況，使用 10 倍、20 倍及 40 倍放大倍數觀察局部雜交信號，拍照。
A, B:斑馬魚中某基因正義RNA探針信號分布；
C, D: 斑馬魚中某基因反義RNA探針信號分布。
以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網站鏈接了解更多技術與產品資訊。
安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。
可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業性的產品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優秀的銷售隊伍以及專業的技術支持，隨時為客戶提供服務。
銷售熱線
