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懸浮細胞的瞬時轉染操作
發布時間： 2024-04-29 點擊次數： 1216次細胞轉染前的準備：
1.細胞：
貼壁生長細胞：一般要求在轉染前一日，必須用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，轉染當日的細胞密度以70%-90%（貼壁細胞），最好在轉染前2-4h換一次新鮮培養液。
懸浮細胞：轉染前12-16h進行懸浮細胞傳代，傳代后適宜的細胞密度為20-40x104/mL。臺盼藍染色進行活細胞計數保持活細胞比在95%以上。
提前將293F細胞的密度調整至合適的密度后（2×106 - 4×106細胞/ml）于37°C搖床培養2-4h后進行轉染。注意，參與轉染的細胞必須是培養三代或以上的穩定細胞株。
2.DNA：使用去內毒素質粒大提試劑盒提取質粒，于生物安全柜/超凈臺用0.22um濾頭過濾除菌。
3.稀釋液：于生物安全柜/超凈臺用0.22 μm濾頭過濾除菌。
4、轉染試劑：轉染試劑如PEI溶液長期儲存于- 20℃，不可反復凍融，溶液在4℃放置不超過一周。
操作步驟（懸浮細胞）：
1、取一支已滅菌的Ep管，加入一定量的DNA，以相應體積的300 mM NaCl稀釋，用槍頭混勻后靜置5 min；
另取一支已滅菌的Ep管，加入相應體積的300 mM NaCl稀釋對應體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min（稀釋液與DNA、PEI的總體積應為轉染體積的5%）。
將質粒和PEI溶液混合，槍頭混勻后靜置一段時間，使DNA與PEI形成穩定的聚合物。
2、從搖床中取出293F細胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉染混合液，邊加邊搖晃搖瓶使轉染更加充分。
3、轉染后將懸浮細胞置于搖床中培養，條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進行細胞計數并用臺盼藍染色液觀察細胞的存活率。
注意事項：
1、DNA純度：使用去內毒素的質粒大提試劑盒，細菌產生的內毒素對細胞狀態有很大的影響。
用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質，無RNA和其他化學物質的污染，確保質粒OD值A260/A280在1.8~2.0之間。
提完質粒后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證DNA的純度，通常情況下DNA為超螺旋狀態（此狀態下轉染效率更高）。
2、優化條件
質粒不同，所轉染的細胞不同及定量的準確性等因素會導致在一些情況下轉染效率低，蛋白表達量低，基于這種情況需要對質粒轉染試劑的配比、DNA的濃度、質粒與轉染試劑的聚合時間進行優化。
3、轉染的稀釋液
研究報道，300 mM NaCl溶液稀釋DNA和轉染試劑轉染效率比普通培養基高。
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