-
慢病毒制備和導(dǎo)入細(xì)胞的操作步驟及注意事項(xiàng)
發(fā)布時(shí)間： 2024-06-06 點(diǎn)擊次數(shù)： 1609次前置知識
通過病毒介導(dǎo)將核酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞是一種常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，被廣泛用于基因傳遞、基因表達(dá)和功能研究等領(lǐng)域。這個(gè)實(shí)驗(yàn)通常分為以下6個(gè)部分：
1.選擇適當(dāng)?shù)牟《据d體：常用的病毒載體包括腺病毒（Adenovirus）、腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）和逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）。
2. 構(gòu)建表達(dá)載體：將目標(biāo)核酸（例如基因、RNA等）插入到病毒載體的適當(dāng)位點(diǎn)上，構(gòu)建表達(dá)載體。這通常涉及將目標(biāo)核酸序列克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體質(zhì)粒中，并進(jìn)行驗(yàn)證和測序。
3. 病毒包裝和擴(kuò)增：將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到特定的包裝細(xì)胞中，這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生具有完整病毒基因組的病毒顆粒。病毒顆粒可以通過細(xì)胞培養(yǎng)和病毒擴(kuò)增過程進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。
4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將目標(biāo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，然后將病毒顆粒加入培養(yǎng)基中與細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。病毒顆粒會(huì)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。
5.核酸導(dǎo)入和表達(dá)：一旦病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它會(huì)釋放出核酸負(fù)鏈，該負(fù)鏈會(huì)被細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制利用。目標(biāo)核酸的表達(dá)產(chǎn)物（例如蛋白質(zhì)）會(huì)在細(xì)胞內(nèi)合成，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要發(fā)揮其功能。
6.實(shí)驗(yàn)分析：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模梢詫?xì)胞和表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分析。這可能包括檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平、功能研究、細(xì)胞行為觀察等。
操作步驟
A 慢病毒制備：
1、提前一周復(fù)蘇293T細(xì)胞，使用10% FBS-DMEM培養(yǎng)基傳代3次以上。
轉(zhuǎn)染前一天將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞用0.25%胰酶消化，得到細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，稀釋到10個(gè)/mL；
將293T接種到6孔板（每孔接種2 mL），使其密度為40%。
待其生長到孔板面積80-90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2、通過質(zhì)粒大提獲得無內(nèi)毒素質(zhì)粒。
3、在1.5mLEP管中分別加入150μL DMEM培養(yǎng)基、15μL lipofectamine 2000。
4、在1.5 mL EP 管中分別加入700μL DMEM培養(yǎng)基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG（使三條質(zhì)粒質(zhì)量比為 4:3:1）。
5、將等體積的質(zhì)?；旌衔锛尤氲睫D(zhuǎn)染試劑混合物中，室溫靜置5min。
6、將隔夜培養(yǎng)的6孔板中培養(yǎng)基小心吸出，替換為新鮮DMEM（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基。每個(gè)孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000復(fù)合物。
7、分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h，收集六孔板中病毒上清液，經(jīng)0.45μm的濾膜過濾或離心去除細(xì)胞碎片（短期內(nèi)可放于4℃保存，長期保存于-80℃冰箱，勿反復(fù)凍融）。
B 慢病毒感染：
1、提前一周復(fù)蘇靶細(xì)胞，傳代三次以上保證細(xì)胞生長狀態(tài)良好。病毒感染前一天將靶細(xì)胞傳代到6孔板，使細(xì)胞生長密度為約20%。
2、待細(xì)胞生長至孔板面積50-60%時(shí)，加入2ml病毒液，加入polybrene,并補(bǔ)加0.5ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)24h。
3、用（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基更換病毒液，恒溫培養(yǎng)24h。
4、加入適量的抗生素篩選，每次換液時(shí)補(bǔ)加抗生素，至靶細(xì)胞細(xì)胞無明顯死亡。
注意事項(xiàng)：
1.選擇合適的載體和元件：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體和啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子等。
2. 細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染密度：細(xì)胞狀態(tài)好，且處于指數(shù)生長階段。靶細(xì)胞密度不宜過高或過低，建議將細(xì)胞密度控制在指數(shù)期的70-80%；
3. 選擇合適轉(zhuǎn)染試劑、比例和轉(zhuǎn)染時(shí)間：選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑，不同類型的細(xì)胞和外源DNA可能需要使用不同的試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
同時(shí)，還需要對慢病毒質(zhì)粒、DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化?？稍诟腥景屑?xì)胞時(shí)加入適量的聚凝胺提高轉(zhuǎn)染效率。
4.抗生素濃度：可在轉(zhuǎn)染前做MTT實(shí)驗(yàn)探究其工作濃度，選取合適的篩選濃度使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠存活并形成穩(wěn)定的細(xì)胞系。
5.篩選時(shí)間：在進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要進(jìn)行足夠長的篩選時(shí)間以檢測出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染后可通過WB，流式細(xì)胞術(shù)，Dot blot等方法驗(yàn)證。
6．對照組設(shè)置：設(shè)置陽性和陰性對照以評估轉(zhuǎn)染效果和篩選是否成功。
以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。
可以在第一時(shí)間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠?yàn)閺V大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊(duì)伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶提供服務(wù)。
-
血清系列
-
細(xì)胞轉(zhuǎn)染
-
支原體清除
-
細(xì)胞凍存
-
實(shí)驗(yàn)耗材
-
分子試劑
-
細(xì)胞增殖與凋亡
-
Biozellen系列
-
培養(yǎng)基
-
ELISA試劑盒
-
TOYOBO（東洋紡）
-
ZYMO RESEARCH
-
Greiner（格瑞納）
-
IKA（艾卡）
-
化學(xué)發(fā)光底物（ECL）
-
PROSPEC系列
-
Epigentek系列
-
微生物檢測
-
細(xì)胞生物學(xué)
-
Corning康寧
-
解離試劑
-
細(xì)胞類-實(shí)驗(yàn)耗材
-
原代細(xì)胞
-
植物檢測系列試劑盒
-
SERANA
-
細(xì)胞系
-
生化試劑盒
-
環(huán)境檢測系列試劑盒（AKEN）
-
類器官培養(yǎng)
-
緩沖器和解決方案
-
生物三凝膠基質(zhì)
-
細(xì)胞因子分子
-
生物樣本庫
-
蛋白研究系列
-
修飾檢測試劑盒
