一、Small RNA 的概念

Small RNA是長度小于200nt的一類非編碼RNA，承擔著關鍵性的調控功能，主要包括三類，分別是miRNA、piRNA以及 siRNA，其中以miRNA研究最為廣泛。Small RNA的5'和3'末端分別有自由的磷酸基和羥基，正是基于這一結構特點，Small RNA測序采用5'、3'兩端連接接頭法進行Small RNA文庫構建。

二、Small RNA建庫的原理

1.3'接頭連接

將RNA和3'接頭置于70℃條件下進行變性，打開RNA及3'接頭可能存在的二級結構。利用酶將 Small RNA的3'羥基和3'通用接頭進行連接。

2．多余3'接頭封閉

為了防止多余的3'接頭與5'接頭連接產生接頭二聚體，在5'接頭連接之前，需要將多余的3'接頭進行封閉。封閉是通過加入RT Primer與多余的3'接頭反向互補形成雙鏈結構，從而有效阻止其與5'接頭連接，達到減少接頭二聚體的目的。

3.5'接頭連接

5'接頭連接是基于Small RNA的5'端含有磷酸基團，利用酶將5'接頭與Small RNA進行連接。如需要測試的Small RNA 5'端不含磷酸基團，則連接不上5'接頭。5'接頭為RNA接頭，自身可能形成二級結構，使用前需要將5'接頭的二級結構打開。

4．cDNA合成

利用3'接頭封閉時加入的RT Primer作為引物進行逆轉錄合成cDNA。

5．PCR富集

使用帶有P5、P7的引物進行文庫富集。

6．文庫分選

擴增后的文庫會有擴增引物殘留及rRNA污染。純化后的文庫推薦使用PAGE膠進行分選，可直觀獲得目的條帶。也可以使用雙輪磁珠分選，但分選范圍較廣，得到的Small RNA文庫純度較低。分選后的文庫miRNA在147bp處左右。

三、Small RNA建庫的操作流程

·Small RNA 建庫

Vazyme 針對 lllumina 高通量測序平臺定向開發的Small RNA文庫構建專用試劑盒-VAHTS Small RNA Library Prep Kit for lllumina V2 (Vazyme #NR811)。

· Vazyme ＃NR811 產品優勢

1．文庫豐度高：接頭污染少，有效文庫比例高，miRNA比例高、覆蓋種類多，文庫數據質量可靠；

2．樣本兼容范圍廣：動、植物細胞／組織總RNA，分離純化的Small RNA，以及其他類型總RNA（如外泌體總RNA）均可作為起始模板；起始模板投入低至10ng總RNA；

3．多種純化方式可選：NR811中包含文庫構建所需的所有組分，提供磁珠分選和PAGE膠分離兩種文庫純化方式，可根據起始文庫質量任意選擇。

自備材料

1.Small RNA Index Primer

VAHTS Small RNA Index Primer Kit for Illumina (Vazyme #N813-816)。

2．RNA質控

Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent #5067-1513)。

3．文庫質控

Agilent DNA 1000 kit (Agilent #5067-1504)、Agilent High Sensitive Kit (Agilent #5067-4626)。

4．文庫純化

VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411)。

5．文庫分選

5.1PAGE膠分選：

6% Novex TBE PAGE gel 1.0 mM 10-well (Life Technologies #EC6265BOX)、5 x TBE、Ultra GelRed Nucleic Acid Stain （Vazyme ＃GR501）或 SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain（Life Technologies ＃S11494）、3M醋酸鈉（pH 5.2）、無水乙醇、新鮮配制的80％乙醇。

5.2磁珠分選：

VAHTS DNA Clean Beads（Vazyme ＃N411）、新鮮配制的80％乙醇。

6．其他材料

Nucleas-free ddH2O、RNase-free PCR管、低吸附EP管（Eppendorf＃022431021）； Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效產品、PCR儀、磁力架、-80℃冰箱、水浴鍋、離心機。

·注意事項

1．試劑盒各組分應于標注條件下保存：

1.15'接頭RL5 Adaptor為RNA接頭，請置于-85～-65℃保存。

1.2 試劑盒中的各酶類組分，請置于-30～-15℃保存。使用前混勻并進行短暫離心，避免粘附于管壁及管蓋，造成損失；使用時應置于冰上，使用后及時按條件保存，否則會導致酶活降低。

1.3 RL3 Buffer V2比較粘稠，解凍混勻后請短暫離心收集至管底，避免液體粘附于管蓋和管壁，導致試劑損失。

2．RNA樣品質控：

為保證建庫質量，實驗開始前請對RNA樣品進行質控，RNA樣品總量、純度和完整性應滿足以下條件：

2.1以總RNA為起始模板，請使用沉淀法（如trizol法）或者Small RNA專用提取試劑盒提取RNA樣品，確保所使用的提取方法不會損失 Small RNA。

2.2總RNA模板的起始投入量應≥10ng，若起始投入量過低，不能確保文庫構建成功。

2.3 OD260／280比值介于1.8-2.2之間，使用Bioanalyzer進行RNA完整性檢測，RIN值27；使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，則28S：18S≥1.5，且無蛋白質和基因組污染。

3．操作過程注意事項：

3.1實驗過程中請使用RNase-free的槍頭、EP管、PCR管，吸取不同樣品時請更換槍頭。

3.2 請佩戴手套、口罩操作，接觸RNase-free空間外設備或其他工作區間后，請更換手套。

3.3 所有的試劑使用后請立即蓋上管蓋，避免污染。

3.4實驗過程中如需暫停，請嚴格按照使用方法中注明的可停放點將樣品置于合適的溫度下保存，不正確的停放可能會降低建庫成功率。

實驗流程

1.3'接頭連接

將RL3 Adaptor、RL3 Buffer V2、RL3 Enzyme mix V2取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。

不同起始量RNA投入，所需接頭量不同，接頭量不足產出不夠，接頭過量則接頭二聚體殘留較多。推薦按照下表對接頭進行稀釋、如血清、血漿、外泌體RNA提取產物低于Qubit測定下限，則按照最大體積6μl投入，推薦按照10ng總RNA接頭稀釋倍數進行稀釋。

1.1 模板與接頭變性

將RNA底物自身以及RNA底物之間可能存在的二級結構打開。根據模版RNA起始投入量稀釋 RL3 Adaptor，在RNase-free的PCR管中按照下表配制反應體系。

1.2將PCR管置于提前預熱至70℃的PCR儀中反應2min，反應結束后立即取出置于冰上2 min。

1.3向1.2的反應管中依次加入如下組分：

1.4使用移液器吹打10-15次充分混勻，短暫離心收集反應液至管底。將反應管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：

2．多余3'接頭封閉

將RT Primer取出，解凍并混勻，短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。

2.1 根據模版RNA起始投入量，參照表格稀釋RT Primer，再按照下表配制反應體系。

2.2 使用移液器吹打10～15次混勻，短暫離心收集至管底。置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：

3.5'接頭連接

將5'接頭RL5 Adaptor、RL5 Buffer和RL5 Enzyme mix取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。

3.1 5'接頭變性

RL5 Adaptor 自身可能形成二級結構，使用前需變性打開二級結構。根據模版RNA起始投入量，參照表格稀釋RL5 Adaptor，將稀釋好的RL5 Adaptor置于提前預熱至70℃的PCR儀中反應2min，反應結束后立即取出置于冰上。

3.2 按照下表配制5'接頭連接反應體系：

3.3 使用移液器吹打10～15次充分混勻，短暫離心收集反應液至管底。將反應管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：

4． cDNA合成

將RT Buffer和 RT Enzyme mix V2取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用。

4.1 按照下表配制逆轉錄反應體系：

4.2 使用移液器吹打10～15次充分混勻，短暫離心收集反應液至管底。將反應管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：

5．文庫富集

將Universal Primer、Index Primer和 Amplification mix 3取出，解凍混勻后置于冰上備用。5.1 按照下表配制反應體系：

5.2將上述反應液混勻，短暫離心收集至管底。將反應管置于熱蓋的PCR儀中運行如下反應程序：

6．PCR產物純化

6.1 將VAHTS DNA Clean Beads提前30 min從2～8℃取出，靜置使其平衡至室溫。

6.2 顛倒或渦旋振蕩使VAHTS DNA Clean Beads 充分混勻，吸取180μl（1.8x）加入到PCR產物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。

6.3 室溫孵育10min，使DNA結合到磁珠上。

6.4 將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約10min），小心移除上清。

6.5 保持樣品始終處于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

6.6 重復6.5一次。

6.7 保持樣品始終處于磁力架上，室溫下開蓋干燥磁珠約5min。

加入80％乙醇時不要吹散磁珠。

最后移除上清時需使用10μl移液器將殘留液體吸干凈，避免磁珠過分干燥（龜裂）而降低回收效率。

6.8 將樣品從磁力架上取出，加入30μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心吸取28μl上清至一個新的Nuclease-free PCR管中。

洗脫產物可在-30～-15℃暫存一周。

6.9 Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測文庫：取1μl純化后的PCR產物用 Agilent DNA 1000 chip分析，由于2100遷移率的影響，最終文庫的主峰分布可能存在約6-8bp偏差，如下圖所示：miRNA文庫的峰在143-147 bp處，piRNA文庫的峰在153-156bp處。

注：A圖和B圖分別為1μg、100ng小鼠肝臟總RNA起始的Small RNA文庫，147 bp處的主峰為miRNA；C圖為1μg小鼠腎臟總RNA起始的Small RNA文庫，147 bp處的主峰為miRNA，153 bp處的主峰為piRNA。

7.文庫分選

根據6.9步驟中文庫質控的結果選擇文庫分選純化方式，如2100圖顯示120 bp處有較多接頭二聚體、70-80 bp處有較多擴增引物殘留以及160bp和190 bp處有明顯的rRNA，則建議選擇PAGE膠分離；如接頭二聚體、擴增引物殘留以及rRNA較少則可以選擇磁珠進行文庫分選。為確保最終有效文庫的比例，建議使用PAGE膠進行文庫分選。方案A：6％非變性PAGE膠分選文庫

（1）將6％10孔非變性PAGE膠裝置于電泳槽中，向其中加入適量1xTBE電泳緩沖液。

（2）向純化的PCR產物中加入5μl6xLoading Buffer 混勻后離心收集至管底。

（3）取5μl pBR322／Mspl digest DNA Marker緩慢加入PAGE膠樣孔中。

（4）將混有Loading Buffer的PCR產物緩慢加入PAGE膠樣孔中，每個樣品上兩個樣孔，每孔15μl。

（5）上樣完成后，120-150V電壓電泳約1h，不同的電泳裝置電泳遷移速率可能不一致，所需電泳時間有差異，待樣孔中的Loading Buffer藍色指示劑全部跑出膠板后約3-5min方可停止電泳。

（6）將PAGE膠從電泳裝置中取出，將PAGE膠從膠板上剝下。用Gel-red核酸染料染色10 min，在凝膠成像儀中進行觀察，如下圖所示，大約140bp和150 bp處的條帶分別對應于miRNA文庫和piRNA文庫的條帶。

（7）用刀片將對應的條帶割下放于事先準備好的500μl低吸附EP管中（管底已用酒精燈燒過的1ml注射器針頭戳了數個小洞），將500 μl EP管套到1.5ml低吸附EP管中，12,000 rpm（13,800xg）離心2min碾碎膠條。膠條的碾碎程度取決于500μl EP管底部小洞的孔徑，所以只需使用注射器針頭戳穿即可。

（8）離心完成后棄掉500μl EP管，向裝有PAGE膠碎片的1.5ml EP管中加入250 μl GEBuffer，于50℃水浴鍋中溫育1-2h。

（9）將步驟8的EP管于離心機中12,000 rpm（13,800xg）離心2min，將蒸發到管壁的液體收集至管底。

（10）將步驟9的上清轉移至離心過濾柱 Filtration Column中12,000 rpm（13,800xg）離心2 min 收集液體，棄去離心柱，將液體轉移至新的1.5ml低吸附EP管中。

（11）向步驟10的上清中分別依次加入5μl Co-precipitator，30 μl 3M醋酸鈉（pH 5.2）和1ml無水乙醇，振蕩混勻后于-80℃沉淀1h。

（12）取出-80℃沉淀產物，于預冷至4℃的冷凍離心機中12,000 rpm（13,800xg），離心30 min。

（13）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀。向EP管中加入1ml新鮮配制的80％乙醇，于預冷至4℃的冷凍離心機中，12,000 rpm（13,800xg）離心10min。

（14）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀。短暫離心將管壁上殘留的液體收集至管底，小心移除殘留液體，室溫開蓋干燥約10min。

（15）待步驟14產物中殘留的酒精全部揮發，加入15μl Nuclease-free ddH2O溶解沉淀。
（16）2100檢測分選純化的文庫：取1μl分選純化的產物用Agilent high sensitive chip分析，良好的文庫應該如下圖所示，對應的miRNA文庫條帶在147-149bp處。
                 

方案B：雙輪磁珠分選文庫

（1）將VAHTS DNA Clean Beads提前30 min從2～8℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫。

（2）顛倒或渦旋振蕩使VAHTS DNA Clean Beads充分混勻，取25μl純化的PCR產物于200 μl PCR管中吸取32.5μl 磁珠（1.3x）加入到PCR產物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。

 ( 3）室溫孵育5min，使DNA結合到磁珠上。

（4）將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心移取上清至新的Nuclease-free PCR管中。

（5）向步驟4的產物中加入22.5μl磁珠（0.9x），使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。（6）室溫孵育5min，使DNA結合到磁珠上。

（7）將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心棄去上清。

（8）保持樣品始終處于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫下孵育30sec，小心移除上清。

（9）重復步驟8一次。

（10）保持樣品始終處于磁力架上，室溫下開蓋干燥磁珠約5min。加入80％乙醇時不要吹散磁珠；最后移除上清時需要使用10μl移液器將殘留液體吸干凈；應避免磁珠過分干燥（龜裂）而降低回收效率。

（11）將樣品從磁力架上取出，加入17.5 μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器輕輕吹10次打充分混勻，室溫靜置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心吸取15μl上清至一個新的Nuclease-free PCR管中。

（12）2100檢測分選純化的文庫：取1μl分選純化的產物用Agilent DNA 1000 chip 或Agilent high sensitive chip分析，良好的文庫應該如圖所示，對應的miRNA文庫條帶在147-149 bp處。

四、Small RNA建庫的常見FAQ

RT primer 能否在cDNA合成步驟添加？

不能。3'接頭連接完成后加入的RT primer與多余3'接頭反向互補形成雙鏈結構，可以有效阻止5'接頭與3'接頭連接，從而減少接頭二聚體的形成；另外，RT primer與已連上3'接頭的RNA底物方向互補可作為逆轉錄步驟的引物，因此RT primer必須在3'接頭連接完成之后添加。

·除常規的動植物總RNA外，其他類型的總RNA是否可以作為起始模板進行文庫構建？

除動、植物總RNA以及分離純化的Small RNA外，Vazyme ＃NR811可以兼容其他類型的總RNA，比如外泌體總RNA作為起始模板。下圖為以HeLa細胞培養物上清的外泌體總RNA為模板構建的miRNA文庫（起始模板投入80ng）。

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