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【技術(shù)貼】DNA 純化實驗的幾種常用方法

發(fā)布時間： 2021-08-24　　點擊次數(shù)： 10004次

DNA 純化是分子生物學研究中經(jīng)常需要用到的一種方法。一般來說，做DNA 純化有3 個目的：1. 獲得高純度的DNA；2. 濃縮DNA；3. 用DNA做測序，芯片等生物信息學方面的實驗。下面，談一談DNA純化的幾種常用方法。

DNA 純化實驗基本上可以分為 PCR 清潔試劑盒純化法和DNA凝膠回收純化法兩大類。PCR 清潔試劑盒純化法又稱為硅膠膜吸附法。因為它的原理是：硅膠膜可在高鹽條件下結(jié)合 DNA，又可在低鹽條件下與DNA分離。而 DNA 溶液中的其他渣渣包括引物、單核苷酸、酶、礦物油、鹽離子等，因為沒有 DNA 的這種神特性，所以會被分離開來。

如果你的 PCR 產(chǎn)物得到的是單一條帶，*可以直接純化。那么問題來了。如果發(fā)現(xiàn)有雜帶？怎么辦？有哪些辦法可以提取得更干凈？

那么就誕生了我們的第二種方法：DNA 凝膠回收純化法。這種方法簡單粗暴有效率，也能純化得比較*。現(xiàn)在已經(jīng)慢慢地取代了第一種方法，成為了DNA 純化的主流方法。擴增時出現(xiàn)非特異性條帶，那么在膠回收時切膠很重要，切膠時盡量選擇目的基因條帶，可以將目的基因所在的膠的邊緣棄去一些，盡量不要切上含有非特異性帶的膠。切膠之后就是回收了，這里分享個小竅門，回收可以用酚氯仿。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)過酶切、回收等步驟后，損失太大。合適的做法是：簡化步驟、減少核酸在處理過程中的損失，讓較多量的 PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒片斷進入酶連反應——以量取勝。DNA 凝膠回收純化法是很粗放型的，但是成功率很高。如果愿意，你可以試試。

大致的做法是：制作 100 μL PCR 產(chǎn)物；酒精沉淀回收 PCR 產(chǎn)物；PCR 產(chǎn)物及載體酶切；跑回收膠；將回收膠上的 PCR 產(chǎn)物和載體片斷切下，回收到一個試管中；冰凍、碎膠，酚、氯仿抽提，酒精沉淀；加入8微升水、1 微升連接酶和 1 微升連接 buffer，4 度過夜；轉(zhuǎn)化涂板。

PCR 產(chǎn)物回收
1. 制備 100μL PCR 產(chǎn)物。
2. 將 100μL PCR 產(chǎn)物加入一 1.5mL 離心管中，再加入 400μL 雙蒸水，顛倒混勻。加入 900μL 預冷無水乙醇、20μL3M 的醋酸鈉。顛倒數(shù)次混勻。（提示本方法使用的醋酸鈉量較小，但足夠沉淀核酸，并且無需洗鹽。）
3. 4℃靜置 30 分鐘，以利于核酸沉淀。
4. 12000rpm 4℃ 離心 15 分鐘，沉淀核酸。
5. 棄上清，將離心管倒置于干凈吸水紙巾上 5 分鐘。室溫下吹風干燥。（提示可將試管置于超凈臺吹風干燥。如果管底有較多液體聚集，可蓋好管蓋后，輕彈管底數(shù)次，將液體分散掛在管壁上，再打開管蓋吹風。）
酶切直接在回收 PCR 產(chǎn)物的試管中配置酶切體系。1%瓊脂糖回收膠回收（碎膠、酚氯仿抽提法）。
綜上所述，純化的主要目的就是要去除蛋白質(zhì)。而酚氯仿混合液能有效地使蛋白質(zhì)變性，同時抑制 RNAase 的活性，酚氯仿還可以減少酚在核酸溶液中的痕量。所以是一種好東西。

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