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【DNA 電泳】教你做果凍：瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)技巧分享
發(fā)布時(shí)間： 2021-08-26 點(diǎn)擊次數(shù)： 4778次果凍晶瑩剔透，口感 QQ 的，其實(shí)果凍的原料瓊脂糖，也是我們平時(shí)用來(lái)跑電泳的材料，瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)常用以 DNA 切膠回收，DNA 分離和用于佐證 DNA 是否重組、質(zhì)粒等是否切開(kāi)。今天我們就來(lái)聊聊瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的一些小技巧小細(xì)節(jié)。
第一步：膠液的制備
稱取 0.4g 瓊脂糖，置于 200ml 錐形瓶中，加入 50ml 0.5×TBE 稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱，直到瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為 0.8%瓊脂糖凝膠液。總液體量不宜超過(guò)錐瓶的 50%容量。否則會(huì)溢出來(lái)的。還要擦洗微波爐。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。
第二步：膠板的制備
倒膠時(shí)的溫度不可太低，否則凝固不均勻。東一塊西一塊的。果凍做出來(lái)就不好看啦。速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。果凍做出來(lái)里面都是氣泡。怎么吃呀？待膠*凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠。
第三步：加樣
注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。果凍下面被戳個(gè)窟窿，還怎么吃呀？
第四步：電泳
加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在 60-80V，電流在 40mA 以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約 2cm 時(shí)，停止電泳。
第五步：染色
未加 EB 的膠板在電泳完畢后移入 0.5μg/ml 的 EB 溶液中，室溫下染色 20-25 分鐘。
第六步：觀察和拍照
在波長(zhǎng)為 254nm 的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有 EB 的電泳膠板。DNA 存在處顯示 出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。
除這些細(xì)節(jié)之外，還有一些注意事項(xiàng)：
1、酶切時(shí)所加的 DNA 溶液體積不能太大，否則 DNA 溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。
2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1 小時(shí)*降解 1 mg λDNA 的酶量為一個(gè)單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的 DNA 不象 λDNA 那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過(guò)量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì) 可能干擾隨后的反應(yīng)。
3、市場(chǎng)銷(xiāo)售的酶一般濃度很大，為了省著點(diǎn)兒花，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液進(jìn)行稀釋。 另外，酶通常保存在 50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在 10%以下，否則，酶活性將受影響。
4、觀察 DNA 離不開(kāi)紫外透射儀，可是紫外光對(duì) DNA 分子有切割作用。從膠上回收 DNA 時(shí)， 應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300-360nm），以減少紫外光切割 DNA。
5、EB 是強(qiáng)誘變劑，還有中等毒性，就是有致癌性。配制和使用時(shí)都要戴好手套。盡量不要把 EB 灑到桌面或地面上。如果真的不幸灑到桌面或地面上了，凡是沾污了 EB 的容器或物品必須經(jīng)專(zhuān)門(mén)處理后才能清洗或丟棄。
6、當(dāng) EB 放太多了，膠染色過(guò)深，DNA 帶看不清的時(shí)候，可將膠放入蒸餾水沖泡，30 分鐘后再觀察。
以上，安培君介紹了做果凍，啊，不！做瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的一些小技巧小竅門(mén)，也希望大家伙兒做出好吃的“果凍"來(lái)。
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