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ELISA實(shí)驗(yàn)中常遇到的問題、產(chǎn)生的原因與解決辦法

發(fā)布時(shí)間： 2021-09-10　　點(diǎn)擊次數(shù)： 6343次

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，簡稱為 ELISA。ELISA 實(shí)驗(yàn)是一種非常經(jīng)典的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。雖然歷史非常悠久了，但是還是不斷地在臨床和基礎(chǔ)研究中得到應(yīng)用。其主要用于：免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位；研究抗酶抗體的合成；顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)；定量檢測體液中抗原或者抗體成份。小編總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。遇到的問題，可能的原因，解決方法。供大家參考。

問題 1：陽性與陰性不能達(dá)到 2.1 的比值，陰性顏色太深。
可能的原因：陰性對照（也就是陽性對照的除目標(biāo)抗原外的其它成分）中有某種成分與一抗作用。
解決的方法：純化抗原除去干擾成分。

問題 2：陽性與陰性不能達(dá)到 2.1 的比值，陽性顏色太淺。
可能的原因有 3 個(gè)： 1）一抗效價(jià)不好。 2）抗原太稀。 3）封閉時(shí)間過長。
解決的方法： 1）換用一抗或增加一抗用量。 2）增加抗原濃度。 3）縮短封閉時(shí)間，封閉時(shí)間一般 37 攝氏度 3 個(gè)小時(shí)，或者 4 攝氏度過夜。不能比這個(gè)更長了。

問題 3：增加抗原濃度，一抗?jié)舛炔蛔儯@色反應(yīng)沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的梯度。
可能的問題：一抗與抗原的比例已經(jīng)飽和。
解決的方法：增加一抗用量; 或在一抗用量不變的情況下減少抗原濃度做梯度。

問題 4：增加一抗?jié)舛龋@色反應(yīng)沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的梯度。
可能的原因：一抗與抗原的比例已經(jīng)飽和。
解決的方法：增加抗原用量；或在抗原用量不變的情況下減少一抗?jié)舛茸鎏荻取?/p>

問題 5：加完 TMB 顯色后顏色梯度很明顯，但加了硫酸終止反應(yīng)后顏色梯度沒有那么明顯了。
可能的原因：硫酸可能把其它成分都炭化了。
解決的辦法：加少一點(diǎn)硫酸，參考值：50 μlTMB+35 μl 硫酸；或者采用 1M 的 HCL 作為終止液，50ulTMB+50ul1M HCL。

這些步驟里面，一抗和封閉是兩個(gè)關(guān)鍵。如果 ELISA 做不出滿意的結(jié)果，首先應(yīng)該從這兩個(gè)方面改進(jìn)。Elisa 實(shí)驗(yàn)看似簡單，其實(shí)不然。別小瞧了ELISA。光是一個(gè)加樣就有很多講究。

ELISA 中加樣須注意如下問題：
吸取樣品時(shí)，加樣槍吸頭不應(yīng)黏附多余的液體；加樣時(shí)不可 90 度向孔中滴加液體，這樣會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確！不要將吸頭伸入孔中，一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭，另一方面可能會(huì)將孔中的液體吹起來，加樣不準(zhǔn)確！正確的加樣方法應(yīng)為 45 度，吸頭貼著孔壁加入，應(yīng)注意：角度太小，會(huì)使液體殘留在孔壁上，導(dǎo)致加樣不準(zhǔn)確！吸頭應(yīng)當(dāng)貼著管壁和液面的交界處！

綜上所述，Elisa 實(shí)驗(yàn)看似簡單，其實(shí)還是有很多細(xì)節(jié)需要我們注意的。以上介紹了 Elisa 實(shí)驗(yàn)的一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，希望對大家有所幫助。

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