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細胞傳代培養實驗常見問題詳解
發布時間： 2021-12-23 點擊次數： 2651次01 一般拿到細胞后，應該注意什么?
收到細胞先不開蓋,用酒精將整個細胞瓶外壁進行消毒，放在培養箱靜置若干小時后(看細胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照(建議收細胞時的培養基拍一張照片，觀察培養基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細胞100X，200X各兩張)，排除細胞本身污染的情況。
02 何時須更換培養基?
視細胞生長密度而定，常規細胞2-3天更換培養基。
03 細胞何時進行傳代較好?
一般情況下細胞生長至*匯合后就應該傳代，所有細胞生長都有一個要求不宜生長過密(也就是常說的長老了)，但有接觸抑制的細胞，在匯合前就必須進行傳代，這類細胞一般在密度70-80%就進行傳代，否則會引起細胞分化。
04 貼壁細胞如何進行傳代?
去掉原T25培養瓶里面的培養基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;棄PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細胞，顯微鏡下觀察，待細胞變圓，細胞間隙明顯，部分細胞剛開始脫離瓶壁，加4 ml左右*培養液混勻終止消化，將細胞小心吹打下來，1000 rpm/min室溫離心5min;棄上清，細胞沉淀用*培養液重懸，按要求分瓶(視細胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶補足培養基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培養。
05 懸浮性細胞應如何傳代處理?
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，將細胞懸液移入離心管中，1000 rpm/min 室溫離心5 min。棄上清，細胞沉淀用*培養液重懸，按要求分瓶(視細胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加*培養液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培養。有些懸浮細胞趨于成團生長，此時細胞生長狀態良好，當補液時，需避免反復吹打。
06 貼壁細胞傳代如何使用胰酶?
一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過高時，易造成培養基中細胞碎片增多，黑渣子增多，常規細胞傳代時建議用0.05%的胰酶進行消化，對于難消化的細胞可采用0.25%胰酶進行消化，細胞密度過高超過80%時，采用分步消化法。胰酶儲存在–20°C，解凍在4°C進行，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。
07 如何控制胰酶消化時間?
胰酶消化的程度是細胞培養中的一個關鍵步驟：消化過度細胞碎片增多，黑渣子增多，細胞會成片脫落，嚴重影響細胞活性，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。
不同細胞對消化液的敏感性不同，胰酶消化的時間也會有差異。胰酶消化時間與胰酶的濃度，是否含EDTA，胰酶的儲存時間，胰酶的儲存溫度，是否反復凍融，消化加入的胰酶體積，消化溫度及細胞的密度有關。消化對于新購買的細胞，建議客戶先用低濃度的胰酶仔細去摸索一下消化時間，可每隔1分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄最佳消化時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。
08 細胞離心下來的離心速率應為多少?
細胞傳代或凍存時欲回收細胞，其離心速度一般為800-1000 rpm/min，室溫離心5-8分鐘，轉速過高，將造成細胞破裂死亡。
09 如何區分活細胞和死細胞?
顯微鏡下觀察：活細胞中間透亮，飽滿，有光澤，死細胞較暗。也可以通過臺盼藍染色來計算細胞活力。
10 如何用臺盼蘭計數活細胞?
用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200～2000 個/毫升，在0.1 毫升的細胞懸液中加入0.1 毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞，注意計數需在加入臺盼藍10min內完成。有細胞計數儀的，可直接用計數儀進行。
11 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。
12 使用胰蛋白酶加入EDTA是為什么?
EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。
13 可否使用與原先不同的培養基?
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞大都無法立即適應，易造成細胞狀態不好，最終造成細胞無法存活。
14 可否使用與原先不同的血清種類?
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
15 細胞為何生長不均勻?
細胞傳代后放入培養箱沒有搖勻，或者放入時搖勻，但在細胞貼壁前，又移動了培養瓶，頻繁開關培養箱引起的振動或者培養瓶中培養液過少，培養箱擱板表面不平整，這些因素會導致細胞生長不均勻。
16 購買的細胞死亡或細胞存活率不佳
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。運輸過程對細胞有嚴重影響。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80°C太久。
17 細胞抱團怎么處理?
一些懸浮細胞抱團生長是正常現象，大部分懸浮細胞在細胞密度很高的情況下，很可能會出現部分細胞抱團生長的現象，聚團細胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周圍的懸浮細胞，因此在培養懸浮細胞時需控制好細胞密度。如果出現了細胞團，可以通過細胞篩去掉部分較大的細胞團，也可以嘗試一下方法：將細胞懸液收集到15 ml離心管中，靜置20 min左右，小心取上層細胞上清培養(該方法只能去除部分較大的細胞團)。
18 細胞內有空泡，是否是正常現象?
部分細胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等)，這個是正常現象。如果只有少數細胞有內出現極少空泡，則很可能是細胞狀態不佳，可以通過調整血清濃度，控制消化，控制傳代比例及時間等方法來調整細胞狀態;如果大部分細胞出現空泡，且單個細胞內空泡數目偏多，則可能細胞代次較高，細胞老化所致，需更換代次較早的細胞。
19 細胞傳兩代后開始逐漸死亡的原因
很可能是培養體系不適合細胞(未使用推薦的培養體系);或者消化過度，對細胞有嚴重影響;或者是傳代比例不合適(具有密度依賴性的細胞，傳代太稀;或者生長較快的細胞，傳代較密，細胞嚴重堆疊生長)。
20 細胞生長逐漸變慢是什么原因?
細胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過度 2. 傳代過密 3.細胞營養不良 4.細胞頻繁傳代 5.細胞狀態不佳或老化 6.細胞存在污染。
21 培養細胞時應使用5%或10%CO2?
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時，細胞培養時應使用10% CO2;當培養基中NaHCO3為每公升1.5 g時，則應使用5% CO2培養細胞。
22 CO2培養箱之水盤如何保持清潔?
定期(每周一次)更換水盤里面的水，水盤的水必須使用無菌蒸餾水或無菌去離子，水盤中可添加1%硫酸銅以預防霉菌污染。
23 細胞接種密度多少合適?
依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的一個重要原因。按照我們的經驗：一般倍增時間24 h內的細胞，傳代比率1:6-1:12為宜，倍增時間24-48 h的細胞，傳代比率1:3-1:8為宜，倍增時間超過48h的細胞, 傳代比率1:2-1:4為宜。
24 培養中常出現一些黑點，是污染嗎?
首先肉眼觀察培養液是否變渾濁，如果變渾濁，基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養液沒有變渾濁：在顯微鏡下觀察黑點大小和形狀是否規則，是否運動，是做布朗運動還是呈直線型快速移動。如果黑點大小不規則，做布朗運動，黑點可能是細胞碎片(可能是細胞狀態不佳或者消化過度引起的)，也可能是血清反復凍融產生的蛋白沉淀引起的，也可能是細胞的代謝產物。如果黑點大小一致，快速移動，很可能是細菌污染。
25 如何預防細胞培養中黑點的產生?
掌握細胞傳代的最佳時機，不要細胞長老了再傳代;掌握好消化時間，防止消化過度產生細胞碎片;減少血清等試劑的凍融次數;將培養液的PH調到最佳;嚴格控制水質和器皿的清潔。
26 黑點已經產生了，如何進行處理?
如果判定黑點是污染，請及時將細胞處理后丟棄。其他情況，可參照以下進行：
如果是懸浮細胞：收集細胞上清慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養瓶;如果是貼壁細胞：將細胞用PBS洗2-3遍，洗的時候，輕輕拍打培養瓶，讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落，再棄去PBS，消化時先加低濃度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，讓細胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來，去掉低濃度胰酶，然后正常消化細胞，將收集的細胞懸液慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養瓶，并可以嘗試適當增加血清濃度進行培養。
27 培養用dish,flask是否相同？
不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。
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