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熒光原位雜交技術(shù)
發(fā)布時(shí)間： 2021-12-24 點(diǎn)擊次數(shù)： 2187次原理
用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。材料與儀器
人的MyoD1（MYF3)基因探針 人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本
指甲油 甲酰胺 氯化鈉 檸檬酸鈉 氫氧化鈉 吐溫20
恒溫水浴鍋 培養(yǎng)箱 染色缸 載玻片 Nikon E-400熒光顯微鏡 蓋玻片 封口膜 200μL移液器 暗盒步驟
1. 探針變性將探針在75℃恒溫水浴中溫育5 min，立即置0℃，5～10 min，使雙鏈DNA探針變性。2. 標(biāo)本變性（1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3 h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。（2）取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70% 甲酰胺/2x SSC的變性液中變性2～3 min。
（3）立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5 min，然后空氣干燥。
3. 雜交將已變性或預(yù)退火的DNA探針10 uL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18x18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過(guò)夜（約15～17 h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。4. 洗脫此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。（1） 雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
（2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2xSSC中洗滌3次，每次5 min。（3） 在已預(yù)熱42～50℃的1xSSC中洗滌3次，每次5 min。（4） 在室溫下，將玻片標(biāo)本于2xSSC中輕洗一下。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200 uL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。5. 雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）（1） 在玻片的雜交部位加150 uL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。（2） 去掉保鮮膜，再加150 uL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40 min。（3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5 min。（4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加150 uL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20 min。（5） 去掉保鮮膜，加150 uL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40 min。（6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5 min。（7） 重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2xSSC中室溫清洗一下。
（8） 取出玻片，自然干燥。
（9） 取200 uL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。6. 封片可采用不同類(lèi)型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周?chē)忾]。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。7. 熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果先在可見(jiàn)光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開(kāi)熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)及濾光鏡選擇注意事項(xiàng)
相關(guān)溶液的配制
1.20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH調(diào)pH 至7.0）。
2.去離子甲酰胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹(shù)脂加入100 mL甲酰胺中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號(hào)濾紙濾。
3.體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。
4.體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。
5.體積分?jǐn)?shù)50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
6.雜交液：8 μL體積分?jǐn)?shù)25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分?jǐn)?shù)50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10% DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50% DF。
7.PI/antifade溶液
PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終濃度為2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。
PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，——20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
8.DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲(chǔ)存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。
9.封閉液I：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
10.封閉液II：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。
11.熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。
12.洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。
常見(jiàn)問(wèn)題
相關(guān)溶液的配制
1.20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH調(diào)pH 至7.0）。
2.去離子甲酰胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹(shù)脂加入100 mL甲酰胺中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號(hào)濾紙濾。
3.體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。
4.體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。
5.體積分?jǐn)?shù)50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
6.雜交液：8 μL體積分?jǐn)?shù)25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分?jǐn)?shù)50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10% DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50% DF。
7.PI/antifade溶液
PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終濃度為2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。
PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，——20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
8.DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲(chǔ)存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。
9.封閉液I：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
10.封閉液II：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。
11.熒光檢測(cè)試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。
12.洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。
熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門(mén)新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。
與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。
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