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酵母雙雜交(Y2H)實(shí)驗(yàn)操作指南

發(fā)布時(shí)間： 2024-03-21　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2496次

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two hybrid，Y2H) 常用于分析兩種蛋白質(zhì)的相互作用。將兩種蛋白質(zhì)分別克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD）上，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從而分析兩種蛋白質(zhì)的相互作用。

pGBKT7是酵母雙雜交bait表達(dá)載體，旨在表達(dá)GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD,1-147 aa）與bait蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。pGADT7是酵母雙雜交表達(dá)載體，旨在表達(dá)GAL4激活結(jié)構(gòu)域（AD, 768-881 aa）與目的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。

一、酵母感受態(tài)細(xì)胞制備
(1) 將-80℃保存的酵母菌株在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線，30℃培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)4-7d。
(2) 挑取單菌落至含3mLYPDA液體培養(yǎng)液中。
(3) 30℃培養(yǎng)，200rpm 震蕩培養(yǎng)8h。
(4) 當(dāng)菌液OD值約為0.3時(shí)，轉(zhuǎn)移10uL菌液到含50mIYPDA培養(yǎng)液中。
(5) 30℃培養(yǎng)，200rpm震蕩培養(yǎng)16-20h至OD值為015-0.3。
(6) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細(xì)胞。
(7) 將底部沉淀使用已預(yù)熱至30℃的100mLYPDA中重懸酵母細(xì)胞。
(8) 30℃，200rpm，搖3-5h至OD值=0.6時(shí)。
(9) 5min室溫離心收集細(xì)胞。
(10) 將底部沉淀在30mL無(wú)菌超純水中重懸酵母細(xì)胞.
(11) 700g轉(zhuǎn)速5min室溫離心收集細(xì)胞。
(12) 將底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重懸細(xì)胞。
(13) 將懸重懸細(xì)胞分成2管，6000g轉(zhuǎn)速室溫離心30s。
(15) 將底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重懸酵母細(xì)胞，分裝為100uL每管。
二、轉(zhuǎn)化
（1）在干凈的1.5 mL的離心管中并振蕩混勻。
（2）每個(gè)離心管中加入100 µL的酵母感受態(tài)細(xì)胞，500 µL的PEG/LiAc溶液，加入兩種質(zhì)粒，并且將管中的混合物進(jìn)行旋渦振蕩，將其混勻。
（3）在30℃，220 rpm/min的搖床振蕩培養(yǎng)30 min。
（4）往每個(gè)離心管中加70 µL的DMSO，并溫和的上下顛倒混勻。將離心管在42℃水浴中熱激40 min（每隔10 min搖勻1次）。
（5）取出離心管，在冰上靜置2 min。
（6）吸取100 µL并涂布在相應(yīng)的二缺固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，待菌長(zhǎng)好后，挑單菌落于10ulYPDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過(guò)夜。
互作驗(yàn)證：
取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液涂布于四缺平板上，將培養(yǎng)皿置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察是否生長(zhǎng)與顏色變化。
注意事項(xiàng)：
（1）檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞效率，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范。
（2）注意質(zhì)粒使用量，檢查儀器狀態(tài)。
（3）配制新鮮培養(yǎng)基，并做對(duì)照轉(zhuǎn)化，添加抑制劑，同時(shí)增設(shè)嚴(yán)格的對(duì)照組防止自激活。
（4）應(yīng)挑選大的、新鮮的菌株克隆進(jìn)行培養(yǎng)。
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